染料木素对MRSA外排蛋白表达的影响

[目的] 研究染料木素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）外排蛋白的影响。[方法] 通过联合药敏实验检测染料木素影响MRSA对环丙沙星的敏感性;利用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（iTRAQ）技术,检测染料木素作用MRSA41577后菌体蛋白表达量的变化;通过生物信息学方法对差异显著的蛋白进行系统分析;通过qPCR和尼罗红外排实验,探讨耐药相关的蛋白介导细菌耐药的作用机制。[结果] 联合药敏实验结果显示,染料木素能增强MRSA对环丙沙星的敏感性;通过iTRAQ技术检测到差异显著蛋白共有129个,包括60个表达上调的蛋白和69个表达下调的蛋白;生物信息学分析结果显示,与细菌耐药相关的蛋白约有14个,其中,通过主动外排系统介导细菌耐药的蛋白主要有PstB、PstS等;qPCR结果显示,与对照组相比,PstB、PstS的基因表达量分别下降了51.6%和78.6%;尼罗红外排实验结果显示,染料木素与尼罗红之间存在竞争关系,为MRSA41577的竞争性抑制剂。[结论] 染料木素可通过降低MRSA41577外排基因pstB和pstS的mRNA表达量,进而影响PstB、PstS外排蛋白的表达来逆转细菌耐药;此外,染料木素还是MRSA41577的竞争性外排抑制剂,可通过与底物竞争外排的方式,使抗菌药物留在菌体内发挥抗菌作用。     

单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究北大核心CSCD

以食源性单核细胞增生李斯特菌(LM)环丙沙星耐药株为研究对象,旨在调查LM对喹诺酮产生耐药的分子机制。采用琼脂二倍稀释法测定菌株对环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC);通过PCR检测喹诺酮耐药决定区(QRDR)基因突变以及质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布;实时荧光定量PCR检测lde基因在LM菌株中的相对表达量;利用SOE-PCR技术构建lde基因缺失突变株,调查外排泵Lde的作用。结果表明,15株LM耐药菌株GyrA、GyrB、ParC和ParE亚基的氨基酸序列与敏感株100%相似;所有菌株中均未检出PMQR基因。加入外排泵抑制剂利血平后,菌株L28和L47对环丙沙星的MIC值分别下降为原来的1/8和1/4。lde基因在耐药株和敏感株中均有表达,且表达量相近;在环丙沙星的作用下,lde基因在耐药株中的相对表达量增加显著,而在敏感株中的表达量基本没有变化;加入利血平后,lde在耐药株中的表达明显受到抑制。缺失lde基因后,菌株对环丙沙星由耐药转为敏感;利血平存在下突变株对环丙沙星的MIC值不受影响。本研究证明外排泵Lde介导LM对喹诺酮类药物耐药。     

单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究

以食源性单核细胞增生李斯特菌(LM)环丙沙星耐药株为研究对象,旨在调查LM对喹诺酮产生耐药的分子机制。采用琼脂二倍稀释法测定菌株对环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC);通过PCR检测喹诺酮耐药决定区(QRDR)基因突变以及质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布;实时荧光定量PCR检测lde基因在LM菌株中的相对表达量;利用SOE-PCR技术构建lde基因缺失突变株,调查外排泵Lde的作用。结果表明,15株LM耐药菌株GyrA、GyrB、ParC和ParE亚基的氨基酸序列与敏感株100%相似;所有菌株中均未检出PMQR基因。加入外排泵抑制剂利血平后,菌株L28和L47对环丙沙星的MIC值分别下降为原来的1/8和1/4。lde基因在耐药株和敏感株中均有表达,且表达量相近;在环丙沙星的作用下,lde基因在耐药株中的相对表达量增加显著,而在敏感株中的表达量基本没有变化;加入利血平后,lde在耐药株中的表达明显受到抑制。缺失lde基因后,菌株对环丙沙星由耐药转为敏感;利血平存在下突变株对环丙沙星的MIC值不受影响。本研究证明外排泵Lde介导LM对喹诺酮类药物耐药。     

宁夏地区一株奶牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行株的高通量测序分析

【背景】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是一种常见的条件性致病菌,由MRSA感染导致的奶牛乳腺炎给奶牛养殖户带来了重大的经济损失。【目的】了解宁夏地区奶牛源MRSA流行株基因组序列特征,为MRSA感染的防治提供理论依据。【方法】采用琼脂扩散法对分离株ld11进行抗菌药物敏感性试验,同时运用Illumina高通量测序平台对其基因组DNA进行高通量测序,使用网络数据库对获得的测序序列进行处理分析。【结果】药敏试验结果显示分离株ld11对头孢噻呋、磺胺异恶唑、氨苄西林、红霉素、庆大霉素、苯唑西林、克林霉素、四环素和多西环素耐药,数据分析显示分离株ld11携带耐药基因aadD、spc、str、blaZ、mecA、cat(pC194)、erm(A)、norA、tet(k)和tet(M),二者之间有很好的相关性;分离株ld11携带的耐药基因多于MRSA参考菌株,且分离株ld11和MRSA252的亲缘关系较近。COG功能分析和GO注释结果显示,与维持菌体基本功能和菌株生长增殖相关的基因占优势;KEGG通路分析结果显示,属于代谢通路的基因占比最多。从该菌株基因组序列上共检测到4个基因岛、9个疑似的CRISPR序列和1个完整的前噬菌体序列。【结论】揭示了宁夏地区奶牛源MRSA流行株的部分基因组序列信息,为MRSA菌株间基因组序列信息的比较分析及MRSA感染的防控提供参考依据。     

亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响

【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。     

华癸根瘤菌7653R中一个RND型药物外排泵的功能表型及调控鉴定

【目的】研究华癸根瘤菌7653R中MCHK_0866和MCHK_0867编码的RND家族外排泵的功能表型。【方法】对外排泵编码基因及候选调控基因在基因组上的结构进行分析。采用测定OD_(600)观察菌株生长曲线的变化。通过测定最低抑菌浓度检测菌株的药物敏感性,RT-PCR检测目的基因经特定物质处理后表达量的变化。通过细菌单杂交系统初步检测外排泵的转录调控。【结果】MCHK_0866和MCHK_0867所编码蛋白共同组成一个RND家族射流泵。缺失该外排泵后,细菌生长曲线在稳定期OD_(600)数值降低,对萘啶酸、四环素和SDS的敏感性发生变化,萘啶酸处理细菌后2个基因的表达量增加。同时,下游属于Tet R转录因子家族的基因MCHK_0869表达产物作用于MCHK_0867的启动子区域。【结论】该外排泵与萘啶酸的运输有关,缺失后自身生长受到影响,表达受到下游转录因子的调控。     

低浓度红霉素对猪链球菌蛋白表达、交叉耐药性与荚膜多糖的影响

【目的】探索低浓度红霉素对猪链球菌蛋白表达、交叉耐药性与荚膜多糖的影响,为进一步研究饲料中低浓度抗生素促生长剂对环境中微生物的影响奠定基础。【方法】猪链球菌接触低浓度红霉素后,利用蛋白质组学iTRAQ技术,筛选关键差异表达蛋白。同时测定猪链球菌的交叉耐药性和荚膜多糖含量。【结果】共鉴定到差异表达蛋白181个,占总鉴定蛋白的12%,猪链球菌通过改变自身蛋白质组的表达量,以适应红霉素的选择性压力。多数差异表达蛋白参与催化和代谢过程,属于膜蛋白,其中13个ATP结合盒转运蛋白、3个核糖体蛋白、DNA回旋酶上调表达,8个荚膜多糖蛋白、DNA聚合酶Ⅳ下调表达。接触低浓度红霉素后,猪链球菌对多种抗生素出现交叉耐药性,消除红霉素后,药物敏感性恢复。接触低浓度红霉素后,荚膜多糖含量也未发生大幅度变化。【结论】猪链球菌为适应低浓度红霉素的选择性压力,大量表达多重耐药的主动外排泵,增加核糖体蛋白的表达量,降低荚膜多糖蛋白的表达量。     

和厚朴酚抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜形成

【目的】研究和厚朴酚(HNK)抑制MRSA生物被膜(BF)形成的作用机制。【方法】使用TTC法测定了HNK对供试菌株BF的形成和成熟BF的抑制作用;刚果红平板法定性检测了HNK对PIA合成的影响;分光光度法测定了HNK对供试菌株eDNA释放量的影响;RT-PCR技术检测了HNK对供试菌株icaA、cidA以及agrA基因表达量的影响。【结果】HNK对MRSA 41573 BF的形成和成熟BF均有较强的抑制作用,其中,HNK抑制MRSA 41573 BF形成的MIC和MBC分别为10μg/mL和20μg/mL;抑制成熟BF的MIC和MBC分别为50μg/mL和100μg/mL。当用亚抑菌浓度的HNK与万古霉素联合作用后,可显著提高成熟BF对万古霉素的敏感性。HNK能显著抑制PIA的合成,且呈浓度剂量依赖。HNK能抑制供试菌株eDNA的释放量,其中1/8 MIC的HNK作用供试菌株16 h后,与对照组相比,e DNA的释放量降低了28.3%。HNK可抑制供试菌株BF形成的相关基因,其中1/2 MIC的HNK作用供试菌株16 h后,与对照相比,icaA的表达量降低了59.1%,cidA的表达量降低了56%,agrA的表达量降低了72.3%。【结论】HNK能显著抑制MRSA 41573 BF的形成,其作用机制主要是通过抑制icaA和cidA基因表达量,影响PIA和eDNA的合成,进而抑制BF的形成。此外HNK也可通过调控细菌的QS系统影响BF的形成。     

免疫共沉淀筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白相互作用的蛋白

摘要：【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白（A/M2）相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。【结果】成功构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。【结论】ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。     

藤黄微球菌Rpf活性蛋白的制取及其对红球菌VBNC菌体的复苏作用

【目的】克隆藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879(=NCIMB 13267)的复苏促进因子Rpf(resuscitation promoting factor)的基因,在大肠杆菌中表达获取基因重组蛋白,考察对近缘高GC革兰氏阳性菌红球菌Rhodococcus sp.DS471活的非可培养VBNC(viable but non-culturable)菌体的复苏促进生长能力。【方法】抽提制备藤黄微球菌的DNA,确定rpf基因引物进行PCR扩增,利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3表达,以SDS-PAGE检验获取纯化重组蛋白;在培养基中添加Rpf,以MPN(most probable number)法计数、评价对VBNC状态菌体的复苏促进生长效果。【结果】基因测序证实获得藤黄微球菌的rpf基因并在大肠杆菌中表达;SDS-PAGE分析表明获得rpf基因的重组蛋白;该蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有近100倍的复苏促进生长能力。【结论】成功克隆了藤黄微球菌的rpf基因,在大肠杆菌中获得了表达,表明了Rpf蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有复苏促进生长效果。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.