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以离子交换、疏水作用、HPLC和凝胶过滤层析等方法对山羊乳腺生物反应器表达的人促红细胞生成素 (erythropoietin ,EPO)进行了分离纯化 ,初步探讨了其分离工艺 ,结果得到了纯度达到 96%以上的纯品 ,所纯化的EPO分子质量为 32kDa ,糖基化程度根据理论分子质量测算为40 %。Western blot证明所得纯化产品具有天然EPO免疫原性 ,N端氨基酸序列测定与文献报道一致 ,ELISA检测免疫活性为 2 4 0 0 0 0IU mg,表明通过 4步纯化步骤可以得到高纯度的产品 ,为今后工艺放大提供了有力的实验依据。 相似文献
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利用乳腺生物反应器高效地表达重组人乳清白蛋白,但是目标产物分离纯化的难度较大。通过分子模拟计算比较待分离原料中主要蛋白组分的物化性质,包括表面电势和表面疏水性,在此基础上设计了高分辨率、快速的分离纯化工艺。通过硫酸铵沉淀的正交试验条件优化,有效地去除了干扰层析精制过程的IgG杂质,提高了后续疏水层析的稳定性,从而成功地分离开目标蛋白及与其同源的牛乳清白蛋白杂质,得到纯度>95%的rHLA纯品,工艺回收率48.6%。乳糖合成活性和圆二色谱检测结果表明,纯化rHLA具有调节β-1,4-半乳糖苷转移酶活性和天然的空间结构。 相似文献
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重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道从人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)基因重组工程菌E.coliJA221表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Zn^2+选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,benzamidine-Sepharose CL 4B亲和吸附,即得比活达110000IU/mg的纯化产品。样品经SDS-PAGE鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为43kd的单一条带。动力学研究测得 相似文献
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乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的分离纯化及生物活性鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了不同配基密度的SP(Sulfopropyl,磺酸基)离子交换介质,建立了乳腺生物反应器表达重组人乳铁蛋白(Recombinant Human Lactoferrin,rHLF)的纯化方法。以溶菌酶为模型蛋白考察了不同配基密度离子交换介质的静态和动态吸附行为,结果表明介质具有良好的吸附性能。不同配基密度离子交换介质均可纯化得到rHLF,其中,高配基密度(0.24mol/L)的离子交换介质每毫升可以处理50mL rHLF牛乳,rHLF收率为86.5%,纯度为98.5%。圆二色谱的测定结果表明纯化的rHLF二级结构与天然人乳铁蛋白一致。生物学功能实验结果表明,rHLF的铁结合与释放活性与天然人乳铁蛋白相似,浓度为5g/L的rHLF对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用。 相似文献
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乳腺生物反应器制备中表达载体的发展 总被引:6,自引:1,他引:5
腺生物反应器拥有巨大的开发价值,但开发成功的例子却寥寥可数,主要的原因是外源基因的表达量较低,达不到开发生产的要求。提高外源基因表达量的关键在于乳腺生物反应器表达载体的构建。近年来,这方面的新思路、新方法不断出现,本文对此进行了综述。 相似文献
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目的 :获得具有生物学活性的重组人生长激素 (rhGH)。方法 :PBV -GH/DH5α菌体经超声破菌、反复洗涤后获得包涵体。将包涵体变性、复性 ,用硫酸铵盐析 ,离子交换层析和凝胶层析进行纯化。产物经SDS -PAGE、HPLC、N末端 15个氨基酸序列检测验证。结果 :终产物rhGH纯度达 98.2 % ,比活性大于 3.0IU/mg。分子量为 2 2kDa ,N末端氨基酸序列与DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。结论 :从自构建的PBV -GH/DH5α工程菌中获得高纯度、高活性重组人生长激素。其纯化工艺为中试生产提供可靠依据。 相似文献
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利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白 总被引:18,自引:0,他引:18
动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶液中获取重组蛋白。应用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有生产方式简单,产量大,蛋白能进行翻译后修饰等优点,是具有广阔前景的生物医药产业。本文仅就动物乳腺生物反应器的建立、检测、目的蛋白的分离纯化以及存在的问题等作一综述。 相似文献
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目的:用填充床生物反应器培养表达重组人红细胞生成素的工程细胞株C2W,使其达到高密度高表达。方法:将工程细胞株用含5%小牛血清的DF培养基复苏放大培养,当细胞达到10^9时,接种到5L生物反应器中,先用含血清培养基生长培养,再换为无血清培养基表达培养;在整个培养过程中,采用流加方式连续培养,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定细胞的表达水平。结果:接种量约为10^9细胞;细胞罐培养57d,包括含血清生长培养6d,无血清表达培养51d:重组人红细胞生成素平均表达水平为5636U/mL,最高时达7880U/mL;收集无血清培养上清476L,平均每日灌流量8.3L,最高时达12L/日。结论:在适当的条件下,利用填充床生物反应器可使工程细胞株的培养达到长时间、高表达。 相似文献
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利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶III(rhATIII)蛋白质。其中包括: 筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列; 利用山羊的b-酪蛋白基因的启动区, 终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列, 构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达载体。同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin)。再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程, 最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊。我们共获得了5个原代转基因公羊。第一只克隆羊在出生后78 d死亡, 解剖表明: 羊的肺部和肾脏等器官有异常。其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配, 得到转基因后代, 其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明: 转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白; 经Elisa检测表明: 在奶中含有大量活性的rhATⅢ, 在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4 mg/L和3 g/L。此研究证明: 转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ。用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯, 制成注射针剂, 将可用于人的抗凝血酶III缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等。 相似文献
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转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶III蛋白质(rhATIII) 总被引:1,自引:0,他引:1
利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶III(rhATIII)蛋白质。其中包括: 筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列; 利用山羊的b-酪蛋白基因的启动区, 终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列, 构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达载体。同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin)。再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程, 最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊。我们共获得了5个原代转基因公羊。第一只克隆羊在出生后78 d死亡, 解剖表明: 羊的肺部和肾脏等器官有异常。其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配, 得到转基因后代, 其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明: 转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白; 经Elisa检测表明: 在奶中含有大量活性的rhATⅢ, 在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4 mg/L和3 g/L。此研究证明: 转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ。用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯, 制成注射针剂, 将可用于人的抗凝血酶III缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等。 相似文献
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乳腺生物反应器的研究现状 总被引:19,自引:0,他引:19
乳腺生物反应器是将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达,以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白。采用乳腺生物反尖器生产药用蛋白质是一种全新的生产模式,它已经成为生物技术领域发展的重要方面。乳腺生物反应器具有能够生产出具有完全生物活性的药用收白,纯化简单,投资少,成本低,对环境没有任何污染等优点,转基因动物生产药用蛋白可以获得巨额经济效益。 相似文献
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动物乳腺生物反应器的研究进展 总被引:4,自引:0,他引:4
张振龙 《微生物学免疫学进展》2000,28(4):85-89
利用转基因动物反应器生产药用蛋白是生物技术领域的一次革命,而通过动物乳腺是最好的渠道,药物蛋白可通过转基因动物的乳腺随乳汁分泌出来,产量高、易纯化,因此乳腺类似于一个制药工厂。国外已有多种蛋白通过乳朱反应器来制备,有些已进入临床研究阶段。本文主要介绍乳腺生物反应器的研究进展情况。 相似文献
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转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白质(rhATⅢ) 总被引:5,自引:0,他引:5
利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ(rhATⅢ)蛋白质.其中包括:筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列;利用山羊的β-酪蛋白基因的启动区,终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列,构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达栽体.同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin).再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程,最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊.我们共获得了5个原代转基因公羊.第一只克隆羊在出生后78 d死亡,解剖表明:羊的肺部和肾脏等器官有异常.其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配,得到转基因后代,其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明:转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白;经Elisa检测表明:在奶中含有大量活性的rhATⅢ,在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4mg/L和3 g/L.此研究证明:转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ.用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯,制成注射针剂,将可用于人的抗凝血酶Ⅲ缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等. 相似文献
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