家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式

对家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因SP2、SP13和SP16进行克隆、序列分析和时空表达模式检测。运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Ex PASy)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)等有关的生物信息学分析工具,预测和分析3条Serpin基因编码蛋白质的结构与生物学功能。以RPS18(核糖体S18蛋白)为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测3条Serpin基因在家蝇不同发育时期,以及家蝇3龄幼虫中脂肪体、唾液腺、中肠、马氏管和体壁的表达特征。SP2、SP13、SP16基因序列的开放阅读框ORF全长分别为1191 bp、1137 bp和1212 bp,分别编码含396、378和403个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da,等电点分别为9.01、5.98和6.04,蛋白质的N端都含有一段信号肽,并具有Serpin基因的保守结构域,属于Serpin家族。SP2和SP16在蛋白质的C端含反应中心环(Reactive center loop,RCL),而SP13 C端不含RCL。时空表达模式分析结果显示,SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高,而雄蝇的表达量与卵期相比有所下调;SP13基因在蛹中的表达量最高,1龄幼虫和雌蝇中的表达量与卵期相近;SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高,雄蝇与雌蝇的表达量与卵期相比有所下调。在家蝇3龄幼虫的各主要组织中,以体壁为参照,SP2基因在唾液腺表达水平最高,其次是脂肪体,中肠和马氏管均低于体壁;SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高,中肠和唾液腺的表达量低于体壁;SP16基因在唾液腺、中肠、脂肪体和马氏管的表达量均低于体壁。推测Serpin基因在家蝇个体发育和免疫调节中起不同作用。     

家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因在感染白色念珠菌后的表达

研究家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂（ Serpin ）基因 Sp2、Sp13、Sp16 在感染白色 念珠菌后的表达模式。利用白色念珠菌刺激家蝇幼虫,对收集的标本进行逆转录,以 GAPDH 为内参基因,通过qPCR技术检测3条 Serpin 基因在家蝇感染后不同时间点及不同组织中的表达特征,统计分析结果。结果表明,不同时间点感染组和对照组比较, Sp2 mRNA在3 h、6 h和48 h的表达量比对照组高; Sp13 mRNA在6 h的表达量比对照组高,在3 h和24 h时的表达量比对照组低; Sp16 mRNA在6 h、24 h和48 h时的表达量比对照组高,在36 h时的表达量比对照组低。不同组织中感染组和对照组比较, Sp2 mRNA在3 h时,在血淋巴和脂肪体中的表达量比对照组高,在马氏管、气管和肠道的表达量比对照组低;12 h时,在血淋巴中的表达量比对照组高,在马氏管和唾液腺中的表达量比对照组低;24 h时,在脂肪体中的表达量比对照组低;48 h时,在血淋巴中呈高表达,在唾液腺中的表达量比对照组低。 Sp13 mRNA在3 h时,在唾液腺和脂肪体中的表达量比对照组高,在马氏管、体壁、血淋巴和气管中的表达量比对照组低;12 h时,在血淋巴中呈高表达,在体壁和脂肪体中的表达量比对照组低;24 h时,在血淋巴、气管和唾液腺中的表达量比对照组高,在脂肪体中的表达量比对照组低;48 h时,在马氏管、血淋巴、气管和脂肪体中的表达量比对照组高,在体壁和唾液腺中的表达量比对照组低。 Sp16 mRNA在3 h时,在马氏管和气管中的表达量比对照组低;12 h时,在马氏管和脂肪体中其表达量比对照组低;24 h时,其表达量在马氏管中比对照组高,在脂肪体中比对照组低;48 h时,在血淋巴中呈高表达,而在马氏管中的表达量比对照组低。家蝇3种 Serpin基因在白色念珠菌感染后均呈现出差异性表达,推测 Serpin 基因在家蝇免疫调节中具有协同调节作用。     

家蝇伴侣蛋白CCTδ基因克隆、序列分析及表达模式的研究

旨在对家蝇伴侣蛋白CCTδ基因进行c DNA克隆、序列分析,并对其时空表达模式进行初步探索。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫c DNA质粒文库中筛选到家蝇CCTδ基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行结构与功能分析,构建系统进化树。取家蝇不同生活史时期虫体(卵、各龄幼虫、蛹、雄雌成虫),3龄幼虫不同组织部位(体壁、气管、唾液腺、脂肪体、马氏管及中肠),采用实时荧光定量PCR分析CCTδ基因在家蝇不同发育阶段和组织部位的表达情况。结果显示,经PCR扩增后,得到了1 600 bp左右的特异性家蝇CCTδ基因片段;CCTδ基因ORF全长1 602 bp,编码533个氨基酸,理论分子量57.16 k D,等电点为7.50;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;进化树分析显示其具有较好的保守性,与中华按蚊的遗传距离较近。时空表达谱显示:该基因在家蝇不同发育时期均有表达,以蛹期表达量最高;在3龄幼虫不同组织中,以气管表达量最高。成功克隆了家蝇CCTδ基因并初步探索了其时空表达模式。     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

家蝇GNBP3基因克隆及感染白色念珠菌后的表达

对家蝇GNBP3基因进行克隆及生物信息学分析,并对该基因在感染白色念珠菌Candida albicans后的表达情况进行研究。从构建的家蝇Musca domestica幼虫c DNA质粒文库中筛选到GNBP3基因,克隆并运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。白色念珠菌注射感染家蝇幼虫并收集标本,逆转录,通过荧光定量PCR检测感染样本中GNBP3基因的表达情况,结果进行统计学分析。研究结果表明,GNBP3基因ORF全长1473 bp,编码490个氨基酸,理论分子量为55.8 k Da,等电点为6.85;感染后不同时间点,感染组与对照组比较,在3 h、12 h、36 h、48 h GNBP3 mRNA的表达明显增高,两组比较有显著性差异(P0.05),而24 h表达差异性最小;感染后不同组织中感染组与对照组比较,3 h和12 h时,在体壁、血淋巴、脂肪体中的表达量升高,具有显著性差异(P0.05);24 h时,在血淋巴中的表达量较对照组高,而在唾液腺和脂肪体中的表达量呈下降趋势,均具有显著性差异(P0.05);48 h,在血淋巴和脂肪体中表达量较对照组高,在中肠的表达量较对照组低,均具有显著性差异(P0.01)。成功克隆GNBP3基因且在家蝇感染白色念珠菌后GNBP3的表达水平随时间的推移呈现先升高后降低再升高的趋势,在各组织中以在免疫组织(血淋巴、脂肪体)中的表达显著增高,推测其在真菌识别过程中发挥潜在作用。     

家蚕3-磷酸甘油脱氢酶基因BmGpd的结构特征与表达谱分析

3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）是真核细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶,具有能量传递等重要功能。家蚕Bombyx mori是重要的变态和能量代谢研究模式动物,为了明确GPDH在家蚕中的作用,本研究根据果蝇lethal （2） k05713的蛋白质序列,从家蚕C108品种克隆了2个完整的mRNA转录体,长度分别为3 456 bp和2 979 bp（GenBank登录号为GQ865685和GQ865686）,具有相同的2 166 bp ORF,编码721个氨基酸。克隆拼接了548 bp的第9内含子后,参照大造品种的全基因组数据,推测出BmGpd基因全长27 983 bp（GenBank登录号为EF154335）,包含16个外显子和15个内含子。编码蛋白具跨膜螺旋结构,pI为8.22,分子量为80.5 kD,1~20 氨基酸区域为信号肽序列。分子同源进化和蛋白质基序分析表明,BmGPD是家蚕中一种新GPDH成员,能在大肠杆菌Escherichia coli中诱导大量表达。RT-PCR分析表明,BmGpd基因表达量在5龄中期最高,在3 d的蛹中明显下调,进入滞育时表达量更低;血液中较低,中肠、丝腺、生殖腺和脂肪体中有大量表达。芯片表达谱显示,5龄第3天幼虫头和体壁中表达丰度最高,脂肪体和马氏管中最低,性别差异不显著。EST表达谱显示,4龄第2天中肠中表达丰度最高。RNAi结果显示,家蚕体内存在BmGpd基因产物代谢补偿途径。本研究为深入研究家蚕GPDH的表达调控以及与变态和能量代谢的关系创造了条件。     

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin15的克隆表达及重组蛋白的体外活性分析

为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究.结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20～60℃热处理15 min,或经pH 6～10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15～90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70％.研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路.     

甜菜夜蛾过氧化氢酶cDNA序列克隆、 序列分析和表达特征

过氧化氢酶 (catalase, CAT)作为生物体内的重要物质, 其主要功能是参与活性氧代谢过程, 在清除H₂O₂、 超氧自由基和过氧化物以及阻止羟基自由基形成等方面发挥着重要作用。本研究利用RT-PCR技术和RACE方法首次克隆和分析了甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）CAT基因, 命名为SexiCAT, GenBank登录号为JN051294, 其cNDA序列全长为1 755 bp, 开放阅读框长1 524 bp, 推测编码507个氨基酸。经氨基酸序列比对, 此多肽序列具有高度保守性, 与其他昆虫CAT的序列一致性分别为： 家蚕Bombyx mori （87%）、 黑腹果蝇Drosophila melanogaster （73%）、 埃及伊蚊Aedes aegypti （71%）和赤拟谷盗Tribolium castaneum （70%）。对该基因在甜菜夜蛾各个发育时期以及不同组织表达量的荧光定量PCR分析表明, SexiCAT基因在甜菜夜蛾各个发育阶段的表达水平存在显著差异, 其中成虫期的表达量最高, 是卵期表达量的7倍, 幼虫期次之, 卵期最低; SexiCAT基因在5龄幼虫体壁、 中肠、 脂肪体和马氏管组织中都有表达, 但在脂肪体中表达量最高。甜菜夜蛾SexiCAT基因的成功克隆及同源建模将为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型氧化酶抑制剂提供了基础。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

家蝇Mdsirt1基因在细菌、高温和重金属胁迫下的表达分析

【目的】探究家蝇Musca domestica sirt1基因(Mdsirt1)在各种胁迫条件下的表达模式。【方法】以家蝇2龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增Mdsirt1基因序列并进行生物信息学分析;实时定量PCR(qRT-PCR)检测Mdsirt1在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和成虫)的表达变化,2龄幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和血细胞)中的表达分布,以及胁迫条件(细菌刺激、热激及CdCl_2刺激)下的转录水平变化;通过RNAi干扰Mdsirt1基因表达,观察敲低Mdsirt1表达后家蝇幼虫抗病能力变化,并检测机体氧化应激水平。【结果】家蝇Mdsirt1基因编码蛋白含有SIR2结构域,与厩螫蝇Stomoxys calcitrans SIR2氨基酸序列一致性为66%。qRT-PCR结果显示,Mdsirt1基因主要在家蝇蛹期表达,在家蝇2龄幼虫脂肪体中表达量较高。家蝇幼虫Mdsirt1分别在大肠杆菌Escherichia coli刺激3 h,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激6 h,42℃热激30min以及30 mmol/L CdCl_2刺激48 h时表达量达到最高峰。敲低Mdsirt1表达的家蝇幼虫受到细菌感染(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1∶1混合感染)后存活率较对照组显著降低1.47倍,且敲低Mdsirt1后机体处于氧化应激状态,活性氧自由基水平和丙二醛含量较对照组分别升高1.58和1.59倍。【结论】Mdsirt1参与家蝇幼虫的抗菌免疫应答和抗逆反应。     

脂多糖对家蚕幼虫Toll样受体基因BmToll9-2表达的影响

【目的】Toll样受体是昆虫Toll信号传导途径的一个重要组成成员,对激活昆虫机体对入侵病原微生物的先天免疫应答起着至关重要的作用。本研究旨在探究脂多糖对家蚕Bombyx mori幼虫中Toll样受体基因BmToll9-2基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR分析BmToll9-2基因在家蚕大造品系4龄和5龄幼虫表皮、脂肪体、马氏管、中肠、神经、丝腺、胸部肌肉共7种组织中的表达特征;将脂多糖和大肠杆菌Escherichia coli注射到5龄幼虫体腔内,诱导其免疫系统响应,采用实时荧光定量PCR分析注射后不同时间BmToll9-2基因在中肠中的表达水平。【结果】RT-PCR结果表明,BmToll9-2基因在家蚕4龄幼虫的脂肪体、马氏管、神经和丝腺中高度表达,在5龄幼虫脂肪体、中肠、马氏管和神经中均有较高表达。实时荧光定量PCR结果显示,注射脂多糖能诱导5龄幼虫中肠中BmToll9-2基因转录,在注射后6 h时的诱导效果最好;注射大肠杆菌也能诱导BmToll9-2基因转录,在注射后3和6 h时的诱导效果最好。【结论】家蚕幼虫BmToll9-2基因在脂多糖和大肠杆菌处理后上调表达,提示BmToll9-2受体可能参与昆虫Toll样受体对脂多糖和细菌的识别过程。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

热胁迫下八字地老虎hsc70基因在不同组织转录表达差异性分析

【目的】为探讨八字地老虎Xestia c-nigrum(Linnaeus)Xe-hsc70基因表达与高温耐受性之间的关系,比较热胁迫下Xe-hsc70基因在不同组织中诱导表达的差异。【方法】本研究以八字地老虎4龄幼虫为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得编码热激同源蛋白70(70 ku heat shock cognate,HSC70)的基因(命名为Xe-hsc70)cDNA全序列与基因组DNA序列(Genomic DNA,gDNA),并利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术,比较分析不同热胁迫温度及不同热诱导时间下八字地老虎4龄幼虫体内马氏管、中肠、体壁、脂肪体与唾腺5个组织中Xe-hsc70基因在mRNA转录与蛋白表达两水平上相对表达量的变化。【结果】比较分析克隆得到的Xe-hsc70基因cDNA全序列和gDNA序列,结果表明Xe-hsc70基因含有8个内含子,最大内含子(561 bp)位于5′端非编码区,并含有一个类似热激应答原件HSE的核心结构序列(gaatatgCaGAAtgTTCcaGaa),其余内含子(长度在86~218 bp之间不等)均在编码区内,本研究首次报道了八字地老虎hsc70内含子的具体数目及位置。组织差异性分析显示:在常温25℃条件下,Xe-HSC70在脂肪体中表达量最高,在唾腺中表达量最低;经热激诱导后中肠、唾腺与体壁组织中Xe-HSC70的表达量与对照(25℃)相比显著上调,随着热激时间的延长,表达量呈现出先升高后恢复至对照水平的变化趋势,脂肪体和马氏管Xe-HSC70表达量与对照相比无明显变化。【结论】八字地老虎不同组织在应对热胁迫的过程中,抗逆机制具有明显的差异。Xe-HSC70的不断积累是八字地老虎对热胁迫不断适应的一个过程,其组织中Xe-hsc70基因的高表达在八字地老虎抗热胁迫的过程中起着重要作用,并为从分子水平上研究八字地老虎的抗逆机理提供依据。     

梨小食心虫几丁质合成酶1基因的克隆与表达分析

【目的】克隆梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶1基因,分析该基因的分子特征及时空表达模式,为探析其生理功能奠定基础。【方法】利用简并引物和RACE技术从梨小食心虫5龄幼虫和蛹中克隆几丁质合成酶1基因的全长c DNA序列,同时获得其两个可变剪切外显子序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统进化树。利用RTq PCR技术研究该基因及两个可变剪切外显子在1日龄预蛹不同组织(头、体壁、脂肪体、中肠、气管和马氏管)中以及不同发育阶段(2-5龄幼虫、预蛹、蛹和成虫)的表达特性。【结果】克隆获得梨小食心虫几丁质合成酶1基因,将其命名为Gm CHS1,该基因编码1 565个氨基酸,包含了16个跨膜螺旋,两个可变剪切外显子包含177个碱基,编码59个氨基酸序列,分别命名为Gm CHS1a(Gen Bank登录号:MF000781)和Gm CHS1b(Gen Bank登录号:MF000782)。系统发育树同源分析结果表明,Gm CHS1属于几丁质合成酶1,Gm CHS1a和Gm CHS1b分别归属于可变剪切外显子CHS1a和CHS1b。组织表达模式表明,Gm CHS1基因在体壁中表达量最高,其次是在头和气管中,其余组织中表达量较低或不表达;发育表达模式表明,该基因在各个发育阶段均有表达,幼虫蜕皮期、预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中表达量上调。Gm CHS1a在体壁和头部的表达量高于Gm CHS1b,而在气管和脂肪体中的表达量略低于Gm CHS1b,两者在中肠和马氏管中表达量都很低。在梨小食心虫不同发育阶段,Gm CHS1a的表达趋势表现为在幼虫蜕皮和预蛹-蛹转变过程中高表达;Gm CHS1b在幼虫各个阶段表达量都较低,在预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中高表达。【结论】Gm CHS1a和Gm CHS1b属于昆虫几丁质合成酶1家族,其基因在梨小食心虫不同组织及发育阶段的表达量显著不同,推测其在梨小食心虫发育过程中发挥着不同的作用。本研究为进一步探索该基因在梨小食心虫体内的功能奠定了基础。