我国蚊虫分离的一种新型胞质多形体病毒

0507BS3是从中国新疆喀什地区采集的库蚊和按蚊混合蚊标本分离的病毒株,对C6/36细胞致病变而对Ve-ro和BHK-21细胞不致病变。电镜观察显示病毒颗粒呈圆球形,直径约60nm(n=20),无包膜,单层衣壳,衣壳内有中央核。基因组核酸电泳显示基因组包括10条双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)片段。病毒第10基因片段核酸序列测定显示该片段全长964bp(GenBankID:FJ150869),具有单一开放读码框,编码长度为275个氨基酸的蛋白,分子量约30.8kD。病毒第10基因片段核酸序列比对未发现相似的病毒核酸序列,氨基酸序列与胞质多形体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV)第10基因片段编码的多形体蛋白部分区段匹配。病毒第10基因片段和已知各型CPV第10基因片段核酸序列共同进行系统进化分析显示该病毒位于独立的进化分枝,提示0507BS3病毒可能是一种新型CPV病毒。     

鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析

为研究鸭圆环病毒全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从鸭组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,拼接后对其核酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析.结果表明所获病毒核酸为大小1 995nt的环型DNA,包含6个ORF,与登录在GenBank中克隆株MuDCV(AY228555)的同源性高达97.4%,可见所扩增的核酸序列为鸭圆环病毒基因组序列.     

流行性感冒病毒细胞培养阳性相关影响因素分析

目的分析影响流行性感冒病毒(流感病毒)细胞培养阳性的相关因素。方法对2014年4月—2017年3月采集的流感样病例咽拭子标本进行PCR核酸检测,对检测阳性的样本进行细胞分离培养,以分离得到的阳性样本为病例组,阴性样本为对照组,进行对照分析研究,用Logistic回归对影响病毒分离阳性的因素进行分析。结果1 298份PCR核酸检测阳性样本中,分离阳性率为22.80%(296/1 298)。其中,季节性H3N2占13.79%(179/1 298),甲型流感病毒H1N1占1.54%(20/1 298),乙型流感病毒(Victoria)占7.24%(94/1 298),乙型流感病毒(Yamagata)占0.23%(3/1 298)。样本来源、发病采样时间间隔、原始样本PCR核酸检测结果、不同采样机构和采样至收样时间间隔对病毒分离结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论缩短收样至接种时间间隔以及提高医疗机构的采样水平是提高流感病毒分离阳性率的关键。     

呼吸道病毒核酸快速检测方案的建立与应用

本研究旨在建立一套便携、准确、操作简便的呼吸道病毒核酸快速检测方案。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证免提取的呼吸道病毒处理试剂(extraction-free respiratory virus treatment reagent,RTU)对病毒核酸处理的效果以及超快速荧光定量PCR仪(FQ-8A)对核酸扩增的效果;将RTU和FQ-8A结合构建呼吸道病毒核酸快速检测方案,通过荧光定量PCR仪中Ct值判断阳性检出率,以验证该方案检测临床样本时的准确性。结果表明,RTU与全自动核酸提取仪在提取效果上灵敏度相当;RTU在提取不同病毒类型样本时,与其他3种提取方法效果相当,但RTU提取时间少于5 min;FQ-8A检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)及腺病毒(adenovirus,ADV)与对照仪器ABI-7500具有良好一致性,kappa系数分别为0.938(P<0.001)和0.887(P<0.001),但FQ-8A耗时更短,扩增时间仅在0.5 h左右;RTU和FQ-8A相结合的快检方案与常规检测方案具有高度一致的检出率,其灵敏度为91.70%,特异度为100%,kappa系数为0.944(P<0.001)。总之,通过RTU与FQ-8A的结合构建了一套可在35 min内完成全部流程的呼吸道病毒核酸快速检测方案。该方案准确性高、操作简便,可为呼吸道病毒快速诊断和治疗提供重要支持。     

检测人巨细胞病毒的免疫PCR技术的建立

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是一种广泛传播的病毒,初次感染后,病毒潜伏存在于体内,但可被激活出现复发感染。诊断HCMV近期活动性感染,主要依靠实验室检测。传统的病毒分离、血清中抗CMV-IgM及CMV抗原等的检测,敏感性差,易漏诊;核酸杂交、PCR等方法虽然敏感性高,但既可检出复制的病毒DNA,也可检出潜伏、整合     

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用北大核心

【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV-2)和3型(porcine circovirus 3,PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1,PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2,PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3,PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列,分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针,通过引物浓度和反应条件优化,方法特异性、敏感性和稳定性分析,以及临床样本和猪源产制品的检测验证,建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示,多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生,与其他病原体检测无交叉反应,表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示,体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%,批间均≥98.3%,表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间,与荧光PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用,检出2种及以上混合感染样品39份,其中5份样本同步检出5种病原体阳性;对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证,均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证,2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。     

荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学法病毒灭活效果的研究

本研究探讨利用荧光定量PCR技术评价Sindbis病毒经亚甲蓝光化学处理后灭活效果的可行性。研究采用不同光照强度对Sindbis病毒进行亚甲蓝光化学灭活处理,并用SYBR Green I荧光定量PCR对Sindbis病毒的cDNA进行扩增,同时以细胞病变法做平行对照以测定病毒残余滴度。结果显示在亚甲蓝光化学处理过程中,随着光照强度的增强,病毒残余滴度由6.50 LgTCID50/mL逐渐降低至检测限以下,同时病毒核酸的拷贝数显著下降(P<0.05),并与病毒感染性的降低呈线性相关(R2>0.98)。以上结果表明,亚甲蓝光化学灭活法对Sindbis病毒核酸有破坏作用,病毒核酸损伤程度随光照强度的增强而增加,且与病毒感染性的降低存在相关性,提示荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学法的病毒灭活效果具有可行性。     

博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组质粒的构建及鉴定

构建博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒。通过PCR方法扩增获得博尔纳病痛毒p24基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性。PCR及核酸序列测定证明博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒构建成功。构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p24基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据。     

深圳市首例人感染H5N1病毒病例的实验室诊断及分子特点分析

对深圳首例疑似人禽流感病人的标本,进行了RT-PCR、Real-time PCR检测及病毒分离培养、血清中和试验、抗原比检测及发病早期不同病程多份标本的病毒载量分析;对分离物进行了HA基因、NA基因及M基因的核酸检测.结果表明:患者气管吸出物的H5N1亚型和A型流感病毒的特异核酸均呈阳性,并通过细胞培养分离到禽流感病毒A/Guangdong/2/06(H5N1)株.气管吸取物病毒载量随着病程延长逐渐减少,而血清中和抗体水平逐渐上升达到1∶160之后又缓缓下降.A/Guangdong/2/06株8个片段的核苷酸序列显示,其与2005～2006年中国南部的禽流感分离株高度同源,与越南、泰国、印度尼西亚等分离到的禽流感分离株存在明显的差异.     

长叶车前花叶病毒上海分离株(HRV_(sh))外壳蛋白功能的研究

植物病毒寄主的致病性是由病毒核酸决定的,而由病毒核酸编码的病毒蛋白的功能则是保护病毒核酸不受外界物理及化学因素的破坏作用。至于植物病毒外壳蛋白在感染上是否起作用,是个尚未解决的问题。郁操国等(未发表)曾报道了HRV_(sh)外壳蛋白赖氨酸侧链被三硝基苯磺酸修饰(TNP-HRV_(sh))后,感染力有明显的下降,提出植物病毒外壳蛋白在感染上确有重要作用。本文报道了修饰后的TNP-HRV_(sh)与天然的HRV_(sh)对心叶烟的感染力有干     

嘧肽霉素影响烟草花叶病毒RNA蓄积量的研究

嘧肽霉素是新报道的由土壤中分离筛选出来的不吸水链霉菌辽宁变种(Streptomyces achygroscopicus var.liaoningensis)产生的,其有效成分是胞嘧啶核苷肽类化合物,已获得农药临时登记,该药剂对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)等多种病毒病害具有很好的防治效果。定量竞争PCR(Quantitative competitive PCR,QCPCR)是一种定量检测细胞因子较为精确的方法,其实质是待测核酸(DNA或RNA)与内参模板一起竞争参与PCR反应,并通过电泳将扩增产物在凝胶上明显的分开,从而进一步进行定性或定量分析。     

pVVP3和pVHN核酸疫苗的构建、表达及对肿瘤细胞的作用

用pVAX1载体构建抗肿瘤核酸疫苗 .将鸡贫血病病毒 (CAV)的VP3基因和鸡新城疫病毒(NDV)HN基因插入载体pVAX1的多克隆位点 ,构建了 2个重组基因疫苗pVVP3和pVHN .转染OS732细胞 ,Western印迹及血凝试验检测HN基因表达状况及表达产物的活性 .RT PCR、DNALadder、TUNNEL染色检测VP3基因的表达及表达产物诱导OS732细胞凋亡作用 .酶切鉴定证实成功地构建了两个核酸疫苗 ,并能在真核细胞内表达 .含HN的核酸疫苗pVHN表达后具有血凝活性并致肿瘤细胞表面唾液酸含量降低 (P <0 0 5 ) .pVVP3的转染能导致OS732细胞凋亡 ,凋亡率可达87% .试验结果表明 ,pVVP3和pVHN两个核酸疫苗体外应用后能诱导肿瘤细胞凋亡并显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量     

癌基因的概念研究进展及前景

一、癌基因的概念 癌基因的概念最初来自逆转录病毒。急性转化病毒(如RSV)具有对病毒的致瘤作用及在体外对细胞的转化作用。慢性转化病毒则均具有极弱的致瘤作用。两者之差在于前者多了一段特定的核酸片段,即癌基因。以后才了解到这种病毒中的核酸片段是来自细胞的。即细胞本身本来就存在与病毒癌基因相同源的DNA顺序。     

三种核型多角体病毒核酸同源性的研究

用分子杂交技术研究了黑点银纹夜蛾(Arqyrogramma agnata Stgr,)单粒包埋型核型多角体病毒(简称A,A,SNPV),斜纹夜蛾(Prodenia litura)多粒包埋型核型多角体病毒(简称PL MNPV)以及用A,A,SNPV感染斜纹夜蛾幼虫所获得的多粒包埋型核型多角体病毒(暂称PoI MNPV)三种病毒核酸的同源性,用SDS-Tris酚法分别提取病毒核酸,用内切酶Eco RⅠ酶解,比较了病毒核酸的酶解图谱及分子量,用〔α-~(32)P〕dATP标记的三种病毒核酸Eco RⅠ酶解片段作探针,分别与各病毒核酸的Eco RI酶解片段杂交,结果表明PoI MNPV与PL MNPV的病毒核酸同源,而A,A,SNPV DNA不与PoI MNPV DNA、PL MNPV DNA杂交,无同源序列。     

PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展

在各种高致病性病原体、禽流感病毒、食源性微生物等引起的疾病随时大规模流行的背景下,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对第一例或第一波病例的快速实验室诊断显得尤为重要,同时发展出多种以PCR技术为基础的检测技术以便更加快速、高通量、敏感地对疾病进行诊断、预防或预测。然而,在实际病原体检测中,常常出现灵敏度低、准确性差的结果。PCR增强剂是在PCR及PCR衍生技术中添加的一类物质,其可从产率、特异性、灵敏度等方面提高核酸扩增性能,从而优化核酸检测,解决病原体检测的应用瓶颈,为第一例病原体检出节约宝贵的时间。结合以PCR为基础的核酸体外扩增检测技术对PCR增强剂在其中的应用、优缺点、作用机理进行介绍,以期为病原体核酸检测的实际应用提供一些参考。     

聚丙烯酰胺凝胶固定核酸方法及其应用

固相核酸已被广泛用于DNA/cDNA微阵列、固相PCR及其它核酸与生物分子检测的传感技术中.和硬质玻璃载片相比,三维聚丙烯酰胺凝胶作为固定核酸的载体具有结合核酸容量高、利于反应的类似液相环境和较少的空间效应等优点.综述了丙烯酰胺凝胶作为固定核酸载体的发展历史.着重介绍了丙烯酰胺修饰核酸直接聚合固定的方法以及在DNA芯片、焦测序、固相PCR(克隆)、及全基因组测序等核酸分析中的应用.     

构建一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照品

为快速鉴定腮腺炎病毒核酸检测中由阳性对照引起的交叉污染问题,本研究建立了一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照。该阳性对照为合成的RNA转录产物,在使用相同的引物和反应条件下,该阳性对照在RT-PCR和巢式PCR试验中产生的PCR产物和正常腮腺炎病毒核酸阳性标本的PCR产物片段长度不同,通过比较PCR产物的大小可快速鉴定由阳性对照引起实验室交叉污染。这种新型腮腺炎病毒RNA阳性对照可广泛应用于腮腺炎病毒实验室诊断和基因定型中,对腮腺炎病毒核酸检测可进行良好的实验室质量控制。     

基于微流控芯片的等温扩增技术北大核心CSCD

基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的核酸扩增技术是分子诊断领域的金标准,然而PCR往往包含多个反应温度,涉及长时间的循环升降温过程,且需要在复杂热循环仪中完成,这些都限制了其在现场即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。与传统PCR相比,等温扩增依靠恒定反应温度,反应时间短,检测装置简单,能够提供更加方便、快捷的核酸检测。基于微流控技术的等温扩增检测,通过兼顾微流控与等温扩增两者的优势,能够为POCT分子诊断提供更具竞争力的平台。例如,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控中,多种形式的POCT等温扩增检测展示了其独特优势。文中首先归纳总结了典型的等温扩增技术及其检测方法,然后对不同类型的等温扩增微流控系统进行了分类总结与分析(如功能定位、结构组成、流体控制、系统特点等),最后总结了等温扩增微流控系统在新冠病毒(SARS-CoV-2)等不同病原体检测领域中的应用,并对等温扩增与CRISPR基因编辑等其他新型技术的相互结合进行了介绍与展望。     

大鳄龟感染蛙病毒的PCR检测及组织病理分析

2013年3月成都市某海洋馆送检2只发病大鳄龟(Macrochelys temminckii),临床特征表现为:精神状态萎靡,爬行无力,对外界刺激反应迟钝;颈部和四肢局部红肿,腹甲溃烂,严重部位甚至穿孔,最后死亡。为明确患病大鳄龟的病因,进行了细菌学、组织病理学和PCR检查。细菌学检查阴性;病理组织学观察发现,大鳄龟多组织、器官均发生严重病变,尤其是肾、肝、肺和心的损伤最为严重,表现为明显的变性、坏死和炎症细胞浸润,并在一些病变组织细胞浆内见嗜酸性或嗜碱性包涵体。针对蛙病毒(Ranavirus)病毒的特异性PCR检测扩增出蛙病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因500 bp目的片段,测序后的DNA序列与Gen Bank中已知核酸序列进行Blast比对,发现其与Gen Bank中的蛙病毒主要衣壳蛋白基因同源性达95%~99%。根据组织病理特点及PCR检测结果推测大鳄龟的死亡是感染蛙病毒所致。     

11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较

收集11种不同厂家的灭活型样本保存液,将甲型流感病毒加入保存液和生理盐水中,在4℃、25℃和37℃条件下保存0 h、2 h、4 h、6 h和24 h后,分别提取各组的病毒核酸,并通过逆转录实时荧光PCR检测病毒载量变化,以探究不同样本保存液对病毒核酸保护效果是否存在差异。结果发现不同样本保存液中的病毒载量随保存时间和温度变化存在显著差异。据此可将11种灭活型样本保存液的保存效果分为四类：(1)优秀产品：在任一温度（4℃、25℃、37℃）条件下,即使保存24h时病毒核酸都未发生明显降解,占比27.2%(3/11);(2)良好产品：低温（4℃）和室温（25℃）情况下核酸未出现降解,但在高温（37℃）条件下6 h后保存效果明显下降,占比27.2%(3/11);(3)合格产品：低温（4℃）条件下对病毒核酸具有较好的保护效果,但在室温（25℃）和高温（37℃）情况下随保存时间延长其保护效果显著下降,占比18.1%(2/11);(4)不合格产品：任一保存条件下对病毒核酸的保护效果都较差,甚至加入病毒后立即导致病毒核酸发生快速降解,占比27.2%(3/11)。以上结果说明不同厂家样本保存液对病毒核酸...