紫藤脉花叶病毒cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物(WVMV-BJ)的基因组中分离出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b( )上。获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34．4kDa。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清。微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1／1024,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1／8192。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT-PCR扩增得到长约1500bp的目的片段。将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了含TRSVcp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP。序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%~94.6%。将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的TRSVCP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa。以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

侵染节瓜的小西葫芦黄花叶病毒CP基因的克隆、表达及其抗血清的制备

通过鉴别寄主反应、病毒部分序列测定确定了采自广州白云区表现花叶、斑驳症状的节瓜上的病毒为ZYMV。采用RT PCR方法扩增和克隆了该病毒的外壳蛋白基因 ,连接到原核表达载体pET 2 2b( )上。获得的重组子pET ZCP转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,用IPTG进行诱导表达。SDS PAGE和Westernblot分析表明 ,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,融合蛋白分子量约为 33 0kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子 ,获得了特异性较高的抗血清。ELISA测定其效价为 1 4 0 96     

大豆花叶病毒CP基因原核表达与抗血清制备

根据已报道的大豆花叶病毒(SMV)序列设计引物,扩增SMV的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的SMV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为85.0%～96.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为87.9%～98.9%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose 亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1∶ 3 800的一抗,可用于田间SMV病样检测.     

黄瓜花叶病毒CP基因原核表达及抗血清的制备

把黄瓜花叶病毒 (CMV)西番莲分离物的外壳蛋白 (CP)基因 ,通过BamHI SacI位点定向插入pET 2 2b( )载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导下 37℃培养 6h ,SDS PAGE电泳示表达蛋白分子质量为 31 8kDa ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 9%,表明该蛋白得到了高效表达。用冰冷的氯化钾溶液显色 ,用表达的特异蛋白质条带制备抗原 ,免疫家兔制备出病毒特异抗血清。采用ID ELISA测定抗血清效价为 1 0 -6;抗血清和CMV几个分离物均有特异反应 ,和TMV、菌体蛋白不发生非特异性反应 ;检测病毒灵敏度达 30ng ml,能够从稀释 31 2 5倍的感病植物汁液中检测出病毒     

紫藤脉花叶病毒cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物(WVMV-BJ)的基因组中分离出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上.获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析表明,cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34.4 kDa.将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清.微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法(enzyme-linkedimmunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1/8192.     

小麦黄花叶病毒RNA228kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据小麦黄花叶病毒（ Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ） 核苷酸序列测定结果,将 Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ２ 上的２８ ｋ Ｄａ 蛋白基因克隆到ｐ Ｅ Ｔ１１ａ 上,构建了原核表达载体ｐ Ｅ２８３９ 。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明,经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,２８ ｋ Ｄａ蛋白基因在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）ｐ Ｌｙｓ Ｓ 中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒 Ｒ Ｎ Ａ２ 蛋白特异性抗血清。     

大蒜E病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

设计特异性引物PCR扩增了余杭大蒜病样中的大蒜E病毒 (GarV E)的全长CP基因 ,构建原核表达载体并在大肠杆菌中过量表达 ,纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。Westernblot检测结果表明 ,抗血清与GarV E的CP起强的特异性反应。 7个大蒜样品中 ,内蒙古赤峰市、宁夏银川和甘肃天水等 4个样品受到GarV E的侵染。试验也证明了田间GarV E编码的CP分子量为 35kD ,不同于已报道的其他葱X病毒属成员的 2 8kD外壳蛋白     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制

根据已报道的洋葱黄矮病毒(OYDV)序列设计引物,扩增洋葱黄矮病毒(OYDV)六安分离物外壳蛋白(CP)基因.序列同源性分析结果表明,与目前已报道的OYDV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀初步IgG,然后用Protein A-Red Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,IgG与甘油1: 1混合获得效价1: 4 800的一抗.将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成OYDV检测试剂盒,可用于田间OYDV病样检测.     

小麦TaMAPK2激酶基因的原核表达以及多克隆抗体制备

MAPK蛋白激酶是一类重要的植物胁迫信号调控因子.为了研究小麦MAPK基因的功能,苯试验克隆了小麦MAPK蛋白激酶基因TaMAPK2.为了制备TaMAPK2基因的多克隆抗体,TaMAPK2的非保守区段的DNA序列anti-MAPK2被构建到原核表达载体 pET-28a-(+)上,表达融合蛋白His-antiMAPK2.在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导1h的条件下,融合蛋白His-antiMAPK2表达量达到最大.通过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)得到纯化的His-antiMAPK2融合蛋白.利用新西兰大白兔制备了TaMAPK2基因的多克隆抗体,ELISA竞争抑制法检测抗体效价检测,效价为1:80000,能满足后续试验要求的效价值,为进一步分析TaMAPK2的蛋白定位、表达等提供基础.     

阴道毛滴虫多克隆抗体的制备及Fd基因的原核表达

目的 将阴道毛滴虫铁氧还蛋白（ferredoxin,Fd）基因在大肠埃希菌中诱导表达。方法制备阴道毛滴虫可溶性抗原,多点注射免疫家兔,获得的血清用ELISA测定其抗体效价。将原核表达重组质粒pET3C-Fd转化入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。结果制备出抗阴道毛滴虫多克隆抗体,抗体效价在1：8000以上,用于免疫印迹实验。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。     

黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因(CsHIR1)原核表达及其多克隆抗体制备

该试验用黄瓜霜霉菌侵染黄瓜幼苗,并通过PCR方法克隆其过敏性诱导反应蛋白(HIR)的基因CsHIR1,构建原核表达载体pET28a-CsHIR1,实现在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达;对诱导表达的时间和IPTG的浓度进行了优化;利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备高效价多克隆抗血清。结果表明:该黄瓜过敏性反应诱导蛋白以包涵体的形式表达,最佳诱导时间和IPTG浓度分别为4h和0.5mmol·L-1;经纯化,得到高纯度的分子量为34kD重组蛋白CsHIR1。Western blotting显示CsHIR1的抗体具有较好的特异性。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能奠定了基础。     

黄瓜CsERECTA基因的原核表达及其多克隆抗体制备

ERECTA基因编码一个富含亮氨酸重复序列结构的丝/苏氨酸类受体蛋白激酶,参与调控植物器官的形态建成,在株型控制及抗逆方面也有重要作用。该研究通过构建带有maltose binding protein(MBP)标签的pET21a-CsERECTA融合蛋白原核表达载体,实现了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达,并对诱导表达的温度、时间和IPTG浓度进行了优化。利用镍离子螯合层析纯化得到MBP-CsERECTA融合蛋白,再用rTEV蛋白酶对其进行酶切,得到CsERECTA蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。结果表明,黄瓜CsERECTA蛋白以可溶和包涵体2种形式表达,低温有助于蛋白以可溶性形式大量存在。最佳诱导温度为23℃,诱导时间为6h,IPTG浓度为0.5mmol·L~(-1)。通过Western blot可检测到黄瓜内源的CsERECTA蛋白,说明制备的多可隆抗体具有较好的特异性。多克隆抗体的成功制备为进一步研究CsERECTA的功能奠定了基础。     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1 kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d=PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120 r/min,0.5 mmol/L IPTG诱导60min.经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体.Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础.     

大蒜A病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

根据GenBank报道的大蒜A病毒(GarV-A)序列设计引物、扩增其外壳蛋白基因并进行序列分析.结果表明,GarV-A的CP基因与目前已报道的两种GarV-A不同分离物CP基因的核苷酸序列同源性为98％-99％;氨基酸序列同源性均为98％.将GarV-A CP基因插入表达载体pSBET,在大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株中诱导表达.CP经12％SDS-PAGE和5％-20％SDS-PAGE两次纯化,免疫小鼠获得抗CP血清,Western blotting分析表明确定制备的抗体对CP具有高度特异性,ELISA检测表明制备的抗体能够与天然病毒离子结合,因此可以作为该病毒的检测.     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。