地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆、序列测定及其表达

以克隆的地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增片段为探针。通过原位杂交从2709基因文库中筛选出两个含有完整的2709碱性蛋白酶基因的阳性克隆：Psci和Psc7。对Psc7中的插入片段构建若干亚克隆后测定了其全部DNA序列,结果显示该插入片段含2709碱性蛋白酶及其信号肽与导肽(Pro—peptide)在内的全部编码序列(1140碱基对)及长度分别为299和832碱基对的上、下游序列,该序列同M．Jacobs等克隆的地衣芽孢杆菌NcIB 6816的subtlisin Carlsberg基因序列显示了极高的同源性。通过枯草杆菌-大肠杆菌穿梭质粒Pbe2将克隆的2709碱性蛋白酶基因转入到蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌DB104中,结果表明2709碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了明显的表达。     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆与序列分析

以地衣芽孢杆菌２７０９染色体ＤＮＡ为模板,应用聚合酶链反应方法扩增了碱性蛋白酶基因,ＰＣＲ反应产物在１％琼脂糖凝胶上表现为１条１．１ｋｂ的条带。该片段经电泳纯化后被克隆于大肠杆菌质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ上,获得ａｐｒＬ＾＋克隆株。ＤＮＡ序列分析表明,它与枯草杆菌蛋白酶Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ具有很高的同源性,同样由编码信号肽、前导肽及成熟蛋白的３个部分构成。     

地衣芽孢杆菌碱性果胶酶基因PelA的克隆与原核表达

通过PCR扩增的方法,从本实验室筛选保存的Bacillus licheniformis DG-3 菌株中扩增出碱性果胶酶的结构基因pelA , 序列分析表明,所获PelA 基因与已报道的B.licheniformis 14A菌株的pelA基因的同源性为100%. 将pelA 基因在大肠杆菌中表达,发酵液菌体的碱性果胶酶酶活为12U/mL. 4～8 mmol/L的Ca2 对碱性果胶酶具有显著的激活作用.     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达

目的:获得碱性蛋白酶基因。方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。结果:apr基因片段含1092个碱基对。该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。     

地衣芽孢杆菌D-1产碱性蛋白酶培养条件的优化

为了对产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌D-1的培养条件进行优化,利用10 L发酵罐,采用正交设计19(34)试验,对培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4条件进行优化,得到地衣芽孢杆菌D-1发酵产碱性蛋白酶的最优培养条件为:培养温度37.0℃,pH值7.5,通气量4L/min,搅拌转速300r/min.利用最优条件组合进行验证...     

地衣芽抱杆菌C碱性蛋白酶基因在枯草芽抱杆菌中的克隆及表达

本文采用DNA重组技术,用鸟枪法克隆获得地衣芽抱杆菌C1213碱性蛋白酶基因。对胞外蛋白酶 酶活测定表明,此基因在枯草芽抱杆菌中获得表达及分泌。用SDS-聚丙烯酚胺凝胶电泳法测定其胞外 蛋白质分子量,得知此基因产物与C1213碱性蛋白酶分子量相同。用酶切和琼脂糖凝胶电泳法确定了所 克隆DNA片段的物理图谱,并确定其大小为2.3kb     

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1的发酵优化

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1分离自油田土样。考察了碳源、氮源、金属离子等营养因素对YP1菌株发酵产溶剂稳定性蛋白酶的影响。YP1菌株发酵产胞外蛋白酶的最佳碳源为淀粉,果糖、甘露糖和乳糖显著抑制产酶;最佳氮源为酵母膏,干酪素、酵母粉和牛肉膏促进产酶,玉米浆和尿素显著抑制产酶。Mn^2＋可以显著促进酶活,Mg^2＋可以促进产酶,在初步优化的培养条件下,YP1菌株的胞外蛋白酶产量达980U。     

Bacillus licheniformis6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌6816中扩增了碱性蛋白酶基因（apr),扩增的1.14kb的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-20b中,构建成重组分泌型表达载体pAPR1。pAPR1中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM109（DE3）中得到表达,SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量为30kD,同核酸序列测定所推导的值相符,表达产物占细胞总蛋白的7.5%,重组菌的酶活比出发菌株提高了3.3倍,研究发现,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时存在前肽自动脱落的现象。     

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YP1产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5%(V/V)浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YP1的生长及产胞外蛋白酶的影响.结果表明5%(V/V)浓度的各种烷烃溶剂对YP1蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响,正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶,而十二烷、十四烷,十六烷能提高YP1产蛋白酶1倍以上.发酵液中十四烷的浓度(1%-8%,VIV)与蛋白酶的活力呈正相关性,添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期.培养过程中添加十四烷能导致YP1菌体形态显著变小.首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响.     

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YP1产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5％(V/V)浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YP1的生长及产胞外蛋白酶的影响。结果表明5％(V/V)浓度的各种烷烃溶剂对YP1蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响, 正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶, 而十二烷、十四烷、十六烷能提高YP1产蛋白酶1倍以上。发酵液中十四烷的浓度(1％－8％, V/V)与蛋白酶的活力呈正相关性, 添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期。培养过程中添加十四烷能导致YP1菌体形态显著变小。首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响。     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

地衣芽孢杆菌JF-UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质

地衣芽孢杆菌JF—UN122的发酵液,以硫酸铵分段盐析得粗酶,再经DEAE—Sephadex A—50吸附色素、CM—Sephadex C-50离子交换及Sephadex G—75柱层析等步骤获得电泳纯的碱性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量为31．6KDa。以酪蛋白为底物时,酶的Km为5．26μg／min,Vm为20．8μg／min。酶的最适pH为9．0,最适温度为55℃,pH5～11,55℃以下酶较稳定,对1mol／LH2O2具有一定的耐氧化性。PMSF对酶抑制,二硫苏糖醇(DTT)有保护作用,钙离子、EDTA、SDS、尿素等对酶无明显影响。