植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅰ.PEP羧化酶同功酶的分离和变构特性的比较

本文报导高梁(C_4植物)和小麦(C_3)植物绿色和黄化叶片中PEP羧化酶的一些特性的比较研究。结果表明不同材料叶片的PEP羧化酶对一些代谢物的反应不同。高梁绿色叶片的PEP羧化酶为G6P、Gly和FDP所激活,为油酸和柠檬酸所抑制。G6P、Gly和FDP对小麦叶片(绿色和黄化叶)、高粱黄化叶片的PEP羧化酶则均无激活作用,油酸和柠檬酸的抑制效应也消失或者下降。 比较这些不同来源的PEP羧化酶在DEAE——纤维素柱层析的结果表明它们具有不同的离子特性。在高粱绿色叶片中分得两种具有不同物理学和动力学特性的PEP羧化酶同功酶(PCⅠ;PCⅡ)。它们的Km(PEP)值各为1.66毫克分子和0.181毫克分子。PCⅡ对G6P的反应较迟钝。从NaCl洗脱梯度、聚丙烯酰胺凝胶电泳和对变构效应剂的反应来看,PCⅡ的一些特性接近于小麦的PE羧化酶。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅲ.高粱叶片PEP羧化酶的多构象状态

应用NEM对酶的化学修饰技术,报导了半胱氨酸残基与高粱叶片的PEP羧化酶催化功能的关系。结果表明,NEM修饰使PEP羧化酶活性丧失。酶的失活速度表现为拟一级反应动力学特性。随NEM浓度的增加酶的失活速度加快。不同效应剂对酶的NEM失活具不同影响。油酸和MgCl_2促进酶的失活,G6P、甘氨酸和苹果酸各具有不同程度的保护作用。以P_(0.5)值来比较G6P和甘氨酸的保护效果,其值各为4.17mM和3.44mM。而当这两种效应剂以等量浓度同时存在时,P_(0.5)值下降为0.06mM,表现出它们的协同保护作用。从复合效应剂对酶的热失活速度和最大反应速度(V_(max))的影响亦可看出这种协同作用的存在。上述两方面的结果表明G6P和甘氨酸同时存在时诱发的酶的构象状态与它们分别存在时诱发的构象状态各不相同。根据这些结果提出了高粱叶片的PEP羧化酶可能存在的多构象状态模型,并对其生理意义进行了讨论。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅳ精氨酸残基在高粱叶片PEP羧化酶催化和调节功能中的作用

应用化学修饰的方法观察精氨酸残基在PEP羧化酶的催化和调节功能中的作用。用丁二酮在硼酸盐缓冲液存在下处理PEP羧化酶使酶活性迅速丧失。其失活速度表现为拟一级反应动力学特性。 低温处理(15℃),或者PEP、G6P、甘氨酸,苹果酸,G6P加甘氨酸和PEP加甘氨酸等酶的底物和效应剂的存在对酶的丁二酮失活均具不同程度的保护作用。PEP和G6P的P_(0.5)值各为4mM和1.5mM。 丁二酮对酶的修饰表现为可逆失活。在Tris-H_2SO_4缓冲液中透析可使被丁二酮修饰而丧失的酶活性恢复。 丁二酮处理还使酶失去对G6P的敏感性,但不影响甘氨酸对酶的调节作用。低温(15℃)下丁二酮修饰酶的G6P脱敏速度比常温下(30℃)底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度慢。比较脱敏速度常数(k_(dG6P))前者是0.0116(分~(-1)),后者是0.0562(分~(-1))。甘氨酸的加入不影响底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度而明显降低酶的丁二酮失活速度。 这些结果表明精氨酸残基不仅存在于酶的催化部位并为酶的催化所必需,同时还存在于酶的G6P结合部位而参与G6P对酶的调节功能。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究 V.PEP羧化酶的可逆冷失活

从高梁叶片中纯化的PEP羧化酶在低温下活性迅速丧失,失活是可逆的。将低温失活的酶重新加热至室温酶,活性可以得到恢复。酶的失活速度与介质温度有关。温度越低,失活速度越快。 底物PEP、效应剂G6P、甘氨酸均能防止酶的低温失活。在G6P和甘氨酸同时存在时对酶的保护更为有效。 酶的沉降特性表明在低温下酶由聚合状态(10.2S)解联成低聚状态(4.1S)。而在G6P和甘氨酸的共同保护下,酶在低温下仍保持具有催化活性的聚合状态(10.1S)。 尿索(3M)导致酶的失活,而在G6P和甘氨酸的存在下酶的失活程度大大下降(残存酶活性为53％),而在Mg~(++)同时存在下可使酶对尿素的稳定性大大提高(残存酶活性为79％)。 NaCl,KCl等也具有防止酶低温失活的作用。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的可逆胍变性

纯化的高梁叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)经不同浓度的盐酸胍处理变性失活后,在试验的蛋白浓度范围内,它的失活时间进程的动力学分析表明为一级反应。0.4 M盐酸胍处理25分钟后(O℃),酶的催化活性完全丧失,酶蛋白的远紫外圆二色性光谱、内源荧光光谱及免疫特异性等测定均表明酶的结构发生了深刻变化。甘油及PEP羧化酶的变构效应剂G6P和甘氨酸对酶在盐酸胍溶液中的变性作用有一定的保护效果。变性酶用复性缓冲液稀释20倍后,在最佳条件下,再经30分钟保温,酶的催化活性能恢复70％以上。G6P和甘氨酸能促进变性酶的复性,甘油亦有明显效果。随着酶活性的恢复,它的远紫外圆二色性、内源荧光及免疫特异性也随之恢复,变性酶的复性速率在常温下(25℃)比在低温下(0℃)要快得多。     

高粱叶片PEP羧化酶的溶液构象——近紫外圆二色性光谱研究

用近紫外CD光谱技术追踪了PEP羧化酶与各种配基的相互作用。底物PEP、必需金属离子Mg~( )、PEP-Mg~( )以及效应剂G6P、Gly、G6P-Gly,均可引起高粱叶片PEP羧化酶近紫外CD光谱各不相同的变化。这表明高粱叶片PEP羧化酶分子构象有较大的灵活性,不同的配基与酶相互作用可引起酶分子不同的构象变化,因而使酶分子表现出催化功能、调节特性、必需氨基酸残基的化学反应性以及稳定性诸方面的差异。     

植物磷酸烯醇式两酮酸羧化酶的研究——Ⅵ.葡萄糖-6-磷酸和甘氨酸对高粱叶片PEP羧化酶的稳定效应

高粱叶片的PEP羧化酶对温度很敏感,在45℃下迅速失活。加入变构活化剂G6P或者甘氨酸对酶的稳定性没有明显的影响。但当在C6P和甘氨酸同时存在时,酶对高温的稳定性则大大提高了。PEP羧化酶在低温中也不稳定。4℃下很快失活。酶的这种冷失活现象也可为加入效应剂G6P和甘氨酸所防止。 比较一些多羟基醇类对酶的热稳定性的影响,表明它们都显著地提高酶的热稳定性。山梨醇的保护作用最强,赤藓醇次之,甘油又次之。说明保护效应与保护剂的羟基数有关。应用含有G6P、甘氨酸和甘油(GGG)的缓冲液对提高酶在纯化和贮存过程中的稳定性非常有效。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP 羧化酶经氨基修饰剂TNBS 和PLP 的修饰迅速失活。酶的TNBS 失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS 修饰即失活。TNBS 修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS 失活。计算G6P 和酶的解离常数K_d-2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS 对酶的失活作用。在被TNBS 修饰过程中还导致酶对G6P 迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP羧化酶经氨基修饰剂TNBS和PLP的修饰迅速失活。酶的TNBS失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS修饰即失活。TNBS修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS失活。计算G6P和酶的解离常数K_d=2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS对酶的失活作用。在被TNBS修饰过程中还导致酶对G6P迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅸ.高粱叶片PEP羧化酶的可逆酸变性

在酸性pH下高粱叶片PEP羧化酶的酶活性的丧失伴随着酶蛋白内源荧光强度和ANS-酶复合物荧光强度的变化。经变性缓冲液(pH 3.4)处理导致蛋白质内源荧光强度的下降和ANS-酶复合物荧光强度的增加,同时表现出ANS-酶复合物发射光谱最大荧光波长的轻微蓝移(从493 nm移至487nm)。经pH 2.6和pH 3.4酸处理变性的PEP羧化酶可以借含有DTT或β-巯基乙醇的缓冲液(pH 8.3)恢复大部份酶活性。在最适条件下,酶活性的恢复可达90％以上,随着酶潘性的恢复,酶的荧光特性随之恢复。酶复性过程遵从一级反应动力学。甘油明显减缓酶的复性过程,减缓程度与其浓度有关。酶的效应剂甘氨酸、丝氢酸和G6P提高酶的复性速度,其中甘氨酸最为有效。动力学分析表明无论上述效应剂或甘油存在与否都不改变复性过程的反应级。     

Ca~(2+)对植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的抑制作用

低浓度Ca~(2+)明显抑制高粱、马齿苋及大叶伽兰菜叶片PEPCase活性。Ca~(2+)对马齿苋及大叶伽兰菜PEPCase的抑制程度大于对高粱PEPCase的。Ca~(2+)对PEPCase的抑制作用因底物PEP浓度提高而加强,因必需金属离子Mg~(2+)的浓度增加而减弱。提高Mg~(2+)浓度可解除高粱PEPCase的Ca~(2+)抑制作用,但不能完全解除马齿苋PEPCase的抑制作用。G6P、gly可消除Ca~(2+)对高粱PEPCase的抑制作用,但G6P不能消除Ca~(2+)对马齿苋PEPCase的抑制作用。     

高粱叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶溶液构象状态的紫外差示吸收光谱研究

PEP诱导产生的差光谱在237nm是一强负峰,在252nm附近呈宽负峰。Mg~(2+)产生的差光谱在275nm附近为正的阔峰,在237nm处为一负峰。PEP、Mg~(2+)共同与酶作用的差光谱在263nm附近呈宽的负峰。正效应剂G6P、Gly及GG分别存在条件下PEP羧化酶的差光谱亦各具明显差异,在270nm以下光区内尤其显著。在284nm和291nm为两个负峰,Gly诱导的峰强度大于G6P的,而GG复合效应剂对此两峰的影响表现很大的协同作用。Mal作用于酶的差光谱在246nm处有一负峰。     

色氨酸残基在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化功能中的作用

在pH7.5条件下,用NBS对PEP羧化酶中色氨酸残基进行共价修饰表明,PEP羧化酶中48个色氨酸残基均能被NBS修饰。用邹承鲁图解法求得,其中4个残基为酶表现催化活性所必需的。 PEP羧化酶的变构效应剂G6P、Gly及Mal分别与酶预保温后,再经NBS修饰,前两种处理中,同样浓度的NBS所用修饰的色氨酸残基数和处理后的残存酶活与对照相比有很大的差异,而用Mal处理的,两者与对照相差无几。     

NaCl及KCl对叶绿体膜上偶联因子腺三磷酶活力的调节

在不外加Mg~(2 )的条件下,激活液中加入30 mMNaCl或15 mM KCl,能促进叶绿体膜上偶联因子的腺三磷酶活力。其促进程度与叶绿素浓度、反应底物ATP浓度及DTT的存在有关。但此促进现象可被加入低浓度的EDTA所消除,NaCl及KCl可将叶绿体内含有的内源或结合态的Mg~(2 )释放出来,有活化腺三磷酶的作用。     

高粱和小麦叶片苹果酸酶某些特性比较

比较高粱和小麦叶片的苹果酸酶的某些特性。发现高粱苹果酸酶对NADP-是专一的,未观测到NAD-苹果酸酶的活力。高粱叶片的NADP-苹果酸酶的最适pH随底物浓度不同而异;在0.5 mM苹果酸浓度下酶的最适pH是7.0～7.5,在1 mM和10 mM浓度下最适pH各为7.5～8.0和8.0～8.5,其中以底物浓度10 mM的活性最高。小麦苹果酸酶也具有类似的效应;但与高粱相比较活性较低。两种不同来源的苹果酸酶在动力学特性上有明显的差异,小麦叶片NADP-苹果酸酶的Km(苹果酸)值1.3比高粱大3.4倍。pH、Mg~(++)、Mn~(++)和苹果酸对高粱叶片NADP-苹果酸酶活力具有不同程度的调节作用;在不同pH条件下Mg~(++)、Mn~(++)对高粱叶片NADP-苹果酸酶表现出不同程度的协同性。Mg~(++)、Mn~(++)的亲和力随pH的升高而增大。而对小麦叶片NADP-苹果酸酶活性几乎无多大影响。在我们所试验的浓度下乙酰辅酶A、甘氨酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖1-6二磷酸、琥珀酸以及延胡索酸对高粱NADP-苹果酸酶活性无影响。     

水分胁迫对露花叶片中PEP羧化酶活性及其调节特性的影响

水分胁迫期间露花叶片中PEP羧化酶的活力随胁迫时间的延长明显增加,复水后PEPC同工酶的活力下降。从露花叶片中分离到3个具有不同动力学和物理学特性的PEPC同工酶(PCⅠ,PCⅡ,PCⅢ),其中同工酶PCⅠ只存在于水分胁迫下露花叶片中,复水后消失。 这3个同工酶的K_m(PEP)值不相同;PCⅠ的K_m(PEP)值介于PCⅡ与PCⅢ之间,它在PAGE上的相对迁移率(Rm)比PCⅡ和PCⅢ大,对效应剂G—6—P及Mal的反应不敏感,分子量为PCⅡ之半;PCⅡ被G—6—P激活和被Mal抑制的程度介于PCⅠ与PCⅢ之间,它在PAGE上的相对迁移率和分子量与PCⅢ极相近。     

低温对玉米叶片PEP羧化酶及其调节特性的影响

低温贮存期间,玉米叶片PEP羧化酶活性随贮存时间的延长而明显降低,对效应剂Gly的敏感性也减弱。多羟基醇(甘油和山梨醇)以及PEP羧化酶的正效应剂G-6-P在与Gly和甘油同时作用时,对PEP羧化酶在低温贮存期间的活性和对Gly的敏感性均有保护效应,且对两者的保护程度相一致,表明低温贮存期间PEP羧化酶对效应剂敏感性减弱与其低温失活有直接关系。     

低温胁迫对水稻幼苗PEP羧化酶的影响

水稻幼苗经低温(0℃)处理后,叶片中PEP羧化酶活性明显地降低.Km值增大。经1—2天低温处理者,增加反应底物的浓度,有减少PEP羧化酶活性降低的幅度;当低温伤害严重时(0℃4天),这种效应则消失。这些结果表明:水稻叶片中PEP羧化酶对低温反应是敏感的,其活性的下降是由于该酶对底物的亲和力的降低。     

马齿苋叶片PEP羧化酶的分子特性

马齿苋叶片PEPCase由四个相同的亚基组成,亚基分子量为83kD。远紫外CD光谱分析表明,此酶含有36.6％α—螺旋结构。马齿苋叶片PEPCase可被G6P激活,但不能被Gly、Ser激活。G6P可防止酶的尿素变性和枯草杆菌蛋白酶的作用。这种保护效应与G6P诱导的酶构象变化有关。 从酶对低温、高温及尿素的反应来看,马齿苋叶片PEPCase的稳定性高于高粱叶片PEP—Case,两者的免疫特性和电泳特性亦不同。     

苜蓿二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶体内活化作用的调节

苜蓿RuBP羧化酶的初活性和活化作用在不饱和光强下与光合速率一样随光强增加而增加。缺硫培养苜蓿叶片的光合速率和RuBP羧化酶的含量、初活性及总活性均比对照有不同程度的降低,其中酶的初活性与光合速率两者减少的趋势比较接近,说明RuBP羧化酶的初活性可能在光合CO_2固定作用中具有决定作用。然而,缺硫植株中酶的活化作用比对照明显增高。酶的活化作用与叶片中的叶绿素,6-PG,NADPH及ATP相对酶含量的比值成正比,与体内的酶量成反比。