Cloning and functional expression of an acyl-ACP thioesterase FatB type from Diploknema (Madhuca) butyracea seeds in Escherichia coli

A cDNA of fatty acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase (Fat) from developing seed of Madhuca butyracea has been cloned. The deduced amino acid sequence of the cDNA corresponding to the mature polypeptide showed 30-40% and 60-75% identity to the reported FatA and FatB class of plant thioesterases, respectively. This gene, MbFatB, is present as a single copy in M. butyracea genome and the MbFatB protein was detected clearly in seed tissues of this plant but not in that of Indian mustard (Brassica juncea). Heterologous expression of the MbFatB gene driven by different promoters in E. coli wild type and fatty acid beta-oxidation mutant (fadD88) strains resulted production of the recombinant protein with various fusion tags either as biologically inactive (insoluble) or functionally active forms. Expression of functionally active recombinant MbFatB in E. coli affected bacterial growth and cell morphology as well as changed the fatty acid profiles of the membrane lipid and the culture supernatant. Alteration of the fatty acid composition was directed predominantly towards palmitate and to a lesser extent myristate and oleate due to acyl chain termination activity of plant thioesterase in bacteria. Thus, this new MbFatB gene isolated from a non-traditional oil-seed tree can be used in future for transgenic development of oil-seed Brassica, a widely cultivated crop that expresses predominantly oleoyl-ACP thioesterase (FatA) in its seed tissue and has high amount of unwanted erucic acid in edible oil in order to alter the fatty acid profile in a desirable way.     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。     

光棘球海胆seali基因克隆及表达特性分析

seali基因隶属于PIWI超家族, 其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞发育过程中发挥重要作用。研究经同源比对从光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)性腺转录组数据库中筛选得到seali基因片段, 随后通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends, RACE), 获得其全长cDNA序列。光棘球海胆seali基因cDNA全长3462 bp, 其中3′UTR长度为416 bp, 5′UTR长度为180 bp, 其中3′UTR的加尾信号并非经典的AAUAAA或AUUAAA, 而是较少见的AAUACA。开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)2862 bp, 编码954个氨基酸, 具有保守的PIWI和PAZ结构域, 多重序列比对和系统进化分析结果表明其属于Argonaute家族的PIWI亚家族成员。荧光定量PCR技术检测结果表明, Mnseali基因在光棘球海胆性腺、肠、管足和体腔细胞中均有表达, 在性腺中表达量最高。此外, Mnseali基因为母源因子, 在整个胚胎发育时期均有表达。在卵巢中, 随着卵母细胞的成熟, Mnseali的表达量逐渐升高, 而仅在成熟期的精巢中表达量显著上调。RNA原位杂交结果表明, Mnseali在光棘球海胆性腺的生殖细胞中特异表达, 是光棘球海胆生殖细胞标记基因。该研究为海胆生殖细胞发育相关的研究提供了支撑。     

中国水仙水杨酸甲酯合成酶基因克隆与表达分析

为了解中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)花香气形成的分子机理,以花发育形成相关基因的SSH文库获得的cDNA片段为基础,利用RACE技术从中国水仙花朵中克隆了水杨酸甲酯合成酶基因,命名为NtSAMT1 (GeneBank No. JX273470),其cDNA全长1323 bp,包含1个1131 bp完整阅读框架,编码376个氨基酸,具有Methyltransf_7 superfamily蛋白保守区,与仙女扇(Clarkia breweri) SAMT蛋白(1m6eX)的三维结构相似。系统进化树分析表明,中国水仙与粳稻的SAMT蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明NtSAMT1在大肠杆菌中能高效表达。半定量RT-PCR分析表明,NtSAMT1在花蕾期就有表达,第1天完全开放时各部位均有表达,以雄蕊与雌蕊的表达量最高,第8天已检测不到表达。     

Proteomic Analysis of Chrysanthemum Lateral Buds after Removing Apical Dominance Based on Label-Free Technology

Studying the genetic basis and regulatory mechanism of chrysanthemum lateral bud outgrowth is of great significance for reduction the production cost of cut chrysanthemum. To clarify the molecular basis of lateral bud elongation after removal of apical dominance in chrysanthemum, label-free quantification analysis was used to analyze the proteome changes after apical bud removal. Quantitative real-time PCR (qPCR) was used to analyze the changes in the expression of three plant hormone-related genes. A total of 440 differentially expressed proteins were successfully identified at three time points during the lateral bud elongation. The number of differentially expressed proteins in the three stages (24 h/0 h, 48 h/0 h, 48 h/24 h) were 219, 332, and 97, respectively. The difference in expressed proteins in the three comparison stages mainly involves RNA processing and modification; translation, ribosomal structure and biogenesis; Posttranslational modification, protein turnover, and chaperones. Path analysis showed that there was various physiological activities in the process of lateral bud dormancy breaking and elongation, which involved energy metabolism, biosynthesis, signal transduction and stress response in the growth process of lateral buds. qPCR indicated that the expression of cytokinin synthesis related gene was significantly increased after the removal of apical dominance, while the expression of strigolactones synthesis related gene experiences a dramatic fall to promote the development of the lateral buds. However, there was a drop before a slight increase in the expression of the auxin synthesis related gene, which was mainly due to the removal of apical dominance that led to the loss of indoleacetic acid in the main stem. However, with formation of the new apical source, indoleacetic acid can be released again.     

斑节对虾α-淀粉酶基因的克隆及其表达分析

为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能, 根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon) cDNA文库得到的EST序列, 利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全长序列。该基因序列全长2465 bp, 包括2175 bp的开放阅读框, 编码724个氨基酸, 分子总量为78.9 kD, 理论等电点为4.66。PmAmy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr34-Ser410)和一个C结构域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%, 利用PmAmy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示PmAmy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾PmAmy基因在卵巢发育的过程中均有表达, 表达量有所变化, 虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾PmAmy在整个生长阶段的检测中都有表达, 其中幼体发育过程中存在显著性差异, 糠虾时期PmAmy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了PmAmy可能与斑节对虾的幼体发育相关。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

黄瓜CsPGIP基因的克隆及表达分析

以加工型黄瓜材料NW99为对象,利用RT-PCR技术克隆黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP),并分析其基因编码序列、组织表达特异性和诱导表达模式。结果表明:(1)从黄瓜中克隆到一个PGIP基因,命名为CsPGIP;CsPGIP基因全长1 026bp,读码框987bp,无内含子,编码328个氨基酸残基,具有xxLxLxxNxLt/sGxIPxxLxxLxxL结构域,属于Pgip基因家族。(2)CsPGIP基因与甜瓜PGIP基因同源性最高,与十字花科Pgip基因同源性较高。(3)CsPGIP在黄瓜各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在嫩叶中表达量最高,在茎中表达量最低;该基因表达明显受到水杨酸诱导,可能在抵御外界病原菌入侵过程中起重要作用。     

枸骨IcFPS1基因的克隆、表达及生物信息学分析

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)是三萜皂苷生物合途径的一个关键酶,为研究FPS基因在枸骨中的功能,该研究采用PCR技术将一个FPS基因的cDNA序列从枸骨叶中分离出来,并命名为IcFPS1。结果表明:根据测序结果分析发现扩增获得的IcFPS1基因cDNA长度为1 591 bp,包含一个完整的开放阅读框,大小为1 029 bp。通过序列分析发现枸骨IcFPS1基因编码342个氨基酸,分子量和等电点分别为39.58 kDa和5.18。通过理化性质预测分析发现IcFPS1蛋白不含信号肽,不含有跨膜区域,该IcFPS1蛋白为亲水性蛋白质。通过序列多重比对发现IcFPS1蛋白质与其他植物的FPS蛋白质高度同源,有共同的保守区域和氨基酸序列,其中与西洋参FPS序列的相似性高达89%。通过系统进化树分析发现枸骨FPS蛋白与同属于被子植物的五加科植物FPS蛋白亲缘关系较近,说明FPS基因在进化过程中相对比较保守。根据蛋白调控网络预测分析结果发现该蛋白可能与IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用,参与类异戊二烯的合成代谢过程。通过实时荧光定量PCR分析发现IcFPS1基因在枸骨各个组织部位中均有表达,其中在枸骨根中表达量最高,在茎和雌花中表达量最低。     

长春花丙二烯氧化物合酶基因的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长春花中克隆了丙二烯氧化物合酶(AOS)基因。结果显示:长春花AOS基因(CrAOS)cDNA全长为2 118bp,包括5′和3′非翻译区,polyA尾和一个长1 638bp的开放阅读框,其基因组中不含内含子;CrAOS基因编码的蛋白含545个氨基酸。多重比对表明CrAOS蛋白与其他的AOS蛋白具有较高的相似性,CrAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交表明:CrAOS基因在长春花中为低拷贝。qRT-PCR结果显示:CrAOS在各个组织均有表达但表达量存在差异,在老叶中最高,在幼花中表达最低。对长春花幼苗进行不同处理,结果表明:伤害、低温、甲基茉莉酸、乙烯利处理等可使CrAOS基因表达量显著提高,水杨酸处理对基因表达影响不大。     

翘嘴鲌胰岛素样生长因子igf3基因的克隆及表达分析

为研究翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor 3,igf3)基因在性别调控过程中的作用,基于分子克隆手段RT-PCR和RACE技术相结合方法扩增到翘嘴鲌igf3基因完整cDNA序列,利用qRT-PCR技术检测其在不同组织中的表...     

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低; HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。