血管能抑素,一种新的血管生成抑制因子

血管能抑素(canstatin)是新近发现的血管生成抑制因子,在体外能抑制血管内皮增殖与迁移,并诱导其凋亡,在体内可抑制肿瘤生长。血管能抑素的N端与C端均有抗血管生成和抑制内皮细胞增殖的作用．而N末端诱导内皮细胞的凋亡活性明显高于C末端。血管能抑素能抑制Akt、FAK的磷酸化。血管能抑素诱导的细胞凋亡与PI3K／Akt信号传导通路的抑制作用有关。     

FAK和ILK介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移

黏着斑激酶（FAK）和整合素偶联激酶（ILK）是整合素信号途径中的重要信号转导分子,为阐明两者在血管平滑肌细胞（VSMC）黏附和迁移中的作用,以骨桥蛋白（OPN）作为VSMC黏附和迁移的诱导剂,检测其对FAK和ILK磷酸化以及对两者之间结合的影响.在此基础上,用FAK磷酸化特异性抑制剂黏着斑相关非激酶（FRNK）或ILK反义RNA分别阻断FAK磷酸化或ILK表达,进一步探讨两者在VSMC黏附和迁移中所起的作用.结果显示,OPN诱导可促进FAK磷酸化,诱导10 min后FAK磷酸化水平升高到对照组的2.4倍;与此同时,ILK的磷酸化受到抑制,30 min降至对照细胞的44.6％.OPN诱导FAK磷酸化的同时使FAK与ILK的结合减少.外源性FRNK在VSMC中的过表达显著降低FAK的磷酸化水平,促进ILK磷酸化和FAK与ILK之间的结合,抑制VSMC的黏附和迁移.用ILK反义RNA抑制ILK表达使VSMC在OPN上的黏附增加1.8倍,迁移细胞数降低45.5％.结果提示,FAK和ILK介导OPN诱导的VSMC黏附和迁移过程,两者通过对同一刺激信号产生不同的磷酸化变化而对VSMC的黏附和迁移产生不同的影响.     

粘着斑相关非激酶对骨桥蛋白促血管平滑肌细胞迁移的抑制作用及分子机制

为阐明整合素 β3 粘着斑激酶 (FAK)信号途径在骨桥蛋白 (OPN)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)迁移中的作用 ,用FAK磷酸化特异性抑制剂粘着斑相关非激酶 (FRNK)选择性阻断FAK磷酸化 ,观察对OPN 整合素 β3 相互作用所激活的FAK信号通路的影响及其与OPN诱导VSMC迁移之间的关系 .外源性FRNK在VSMC中的过表达可显著抑制OPN诱导的VSMC迁移 ,使跨膜迁移细胞数下降 5 0 5 8% (P <0 0 5 ) .OPN刺激不但明显诱导FAK表达 ,而且还促进其磷酸化 .外源性FRNK对OPN诱导的FAK磷酸化具有显著抑制作用 ,使磷酸化型FAK水平比相应对照细胞下降5 9 1% ,但其对FAK表达不产生明显的影响 .FRNK还具有下调整合素 β3 表达的作用 ,免疫荧光细胞化学分析结果显示 ,在转染FRNK的VSMC中 ,粘着斑蛋白的磷酸化水平降低 ,粘着斑数量明显减少 .结果提示 ,整合素 β3 FAK是介导VSMC迁移的重要信号途径 ,外源性FRNK通过下调 β3 表达、抑制FAK磷酸化和减少粘着斑蛋白磷酸化及粘着斑形成等机制 ,减弱OPN刺激信号的跨膜转导及沿胞内途径传递 ,发挥抑制OPN促VSMC迁移的效应 .     

基因重组去整合素rAdinbitor对C6神经胶质瘤细胞FAK-Ras/MAPK通路的影响

rAdinbitor为大连医科大学生物化学与分子生物学教研室从旅顺产白眉蝮蛇毒腺中采用克隆技术得到的去整合素．之前研究已证明rAdinbitor具有抑制C6神经胶质瘤细胞增殖、促进C6神经胶质瘤细胞凋亡的作用．rAdinbitor对C6细胞作用的分子机制需要进一步研究．在此研究中,用E. coli BL21/pET23b-adinbitor表达rAdinbitor,通过Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱对rAdinbitor进行纯化,纯化蛋白经Western blotting鉴定．用纤连蛋白(fibronectin,FN)诱导C6细胞．通过免疫沉淀和免疫印迹检测不同浓度的rAdinbitor对FN诱导的C6细胞中黏着斑激酶(FAK)、MEK1/2、Caspase-3的表达以及对FAK、ERK1/2活性的影响．研究表明：各实验组不同浓度的rAdinbitor均能明显降低FAK、MEK1/2的表达,对Caspase-3的表达起促进作用,并对ERK1/2的磷酸化有明显的抑制作用;除10 mg/L rAdinbitor对FAK磷酸化无明显抑制作用外,其余浓度的rAdinbitor对FAK的磷酸化起了明显抑制作用．这说明rAdinbitor对FAK及其下游Ras-MAPK传导通路的抑制在其抑制C6增殖过程中起了重要作用,Caspase-3表达升高提示,rAdinbitor可能通过抑制ILK及其下游的PI-3K/Akt途径起到了促进细胞凋亡的作用.     

Src介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移过程

为阐明酪氨酸激酶Src在整合素被骨桥蛋白(OPN)激活所触发的细胞黏附和迁移信号途径中所起的作用,应用Src特异性抑制剂PP2阻断Src,观察OPN诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)黏附和迁移活性的改变,并利用免疫沉淀检查PP2对整合素下游信号分子黏着斑激酶(FAK)和整合素偶联激酶(ILK)磷酸化及其相互作用的影响。结果显示,PP2可明显抑制OPN诱导的VSMC黏附和伤口愈合(黏附和迁移活性分别为对照组的76.6%和33.8%);OPN可显著诱导FAK磷酸化(磷酸化水平达对照组的1.9倍),促进ILK去磷酸化,并使FAK与ILK的结合减少(降至对照组的46.4%)。10μmol/LPP2可明显抑制OPN诱导的FAK磷酸化、拮抗OPN诱导对ILK的去磷酸化作用、促进FAK与ILK之间的结合。研究结果表明,Src作为OPN-整合素-FAK信号途径中的信号分子,通过影响FAK和ILK的磷酸化以及两者之间的相互作用来调节VSMC的黏附和迁移活性。     

FAK通过和EGFR的相互作用调节MAPK和Akt之间的相对平衡

目的研究上皮生长因子受体和FAK的相互作用以及对下游信号的影响。方法建立聚集粘连激酶(FAK)缺失突变和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因del1-693FAK-GFP、del1-100FAK-GFP和FAK-GFP稳定表达细胞系。结果同野生型FAK-GFP相比,N-端1-100氨基酸残基的缺失突变体,缺失1-693氨基酸残基的突变体结合在黏附点的能力被完全抑制。应用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳证明,EGF和纤维连接蛋白诱导FAK磷酸化的位点不同,进一步证实del1-693FAK-GFP、del1-100FAK-GFP,抑制MAPK的磷酸化,增强Akt的磷酸化;而FAK-GFP增强MAPK磷酸化,抑制Akt磷酸化。结论FAK通过和EGFR的相互作用调节MAPK和Akt之间的相对平衡。     

表氧化二十碳三烯对eNOS磷酸化水平的影响及其相关信号转导通路

内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)是一氧化氮(NO)参与的血管稳态调节过程中的关键酶. 多种体液因子和机械刺激都可以通过磷酸化修饰调节eNOS的活性, 但具体的信号转导通路因刺激物不同而异. 最近发现花生四烯酸细胞色素P450(CYP)表氧化酶代谢产物表氧化二十碳三烯(EETs)可以显著上调eNOS的蛋白表达并增强其活性, 但其分子机制尚不清楚. 通过在4代以内培养的牛主动脉内皮细胞中直接加入外源性EETs和转染CYP表氧化酶基因CYP2C11和CYPF87V, 并同时给予实验组不同信号转导抑制剂进行干预, 观察其对总的eNOS表达及其在Ser1179 和Thr497位点磷酸化水平的影响. 结果显示, 内外源性EETs均可以显著上调eNOS的蛋白表达并增强及其在Ser1179和Thr497位点的磷酸化水平; PI3K抑制剂LY294002可以阻断EETs对eNOS-Ser1179的磷酸化上调作用, 但它对eNOS-Thr(P)497并无影响, 而Akt抑制剂却可以抑制eNOS在这两个位点的磷酸化, 且这两种抑制剂都可以阻断EETs对eNOS的蛋白表达上调作用.结果提示: (i) EETs对eNOS的活性调节可能与PI3K/Akt所介导的eNOS-Ser1179和Akt所介导的eNOS- Thr497磷酸化水平改变相关; (ii) PI3K/Akt信号通路可能参与了EETs对eNOS的蛋白表达上调过程.     

抑癌基因Pdcd4的表达调控及产物泛素化研究进展

程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4,Pdcd4)基因是近年新发现的一种抑癌基因,它的表达产物通过抑制相关基因的转录和翻译抑制肿瘤生成.Pdcd4在多种人肿瘤组织细胞中表达缺失或低表达.有研究发现,5'CpG岛的甲基化可能是脑胶质瘤中Pdcd4基因沉默的主要原因之一.另外,在多种肿瘤细胞中发现microRNA-21的表达水平与Pdcd4蛋白的表达呈负相关性,microRNA-21在转录后水平调控Pdcd4,其作用位点位于Pdcd4mRNA的3′-UTR区.肿瘤细胞中Pdcd4的表达水平与细胞对抗肿瘤药物的敏感性有关,上调Pdcd4表达会增加细胞对某些抗肿瘤药物的敏感性,反之,下调Pdcd4表达则会引起某些药物细胞毒活性的减弱.有些药物本身也可以影响细胞中Pdcd4的表达水平.Pdcd4可以抑制p53的乙酰基化.Pdcd4蛋白能被蛋白激酶Akt/PKB磷酸化,引起Pdcd4的核易位,并减弱Pdcd4对转录激活因子AP-1的抑制作用.Pdcd4可以被蛋白激酶S6K1磷酸化并在泛素连接酶SCFβTRCP介导下经泛素化途径降解.     

mTORC2/Akt的反馈激活可拮抗隐丹参酮对HepG2细胞的抑制作用

目的:研究隐丹参酮对Akt活性的影响及其在抑制HepG2细胞生长中的作用。方法:Western印迹检测隐丹参酮对Akt磷酸化的影响;CCK-8法检测隐丹参酮与MK2206或PP242联合用药对HepG2的生长抑制作用。结果:Western印迹证明隐丹参酮处理能够增强HepG2细胞Akt的磷酸化,同时发现隐丹参酮对Akt的增强作用依赖于mTORC2的活性;通过MK2206或PP242抑制Akt的反馈激活,能够明显促进隐丹参酮对HepG2细胞的生长抑制作用。结论:通过抑制Akt的反馈激活能够增强隐丹参酮的抗肿瘤作用,为隐丹参酮肿瘤治疗的临床应用联合用药提供了理论基础。     

骨桥蛋白趋化和趋触作用对FAK和ILK磷酸化修饰的影响

为探讨可溶性(趋化作用)或锚定(趋触作用)形式的骨桥蛋白(OPN)与整合素相互作用对下游信号分子黏着斑激酶(FAK)和整合素偶联激酶(ILK)磷酸化修饰的影响,分别用包被于培养瓶上锚定型或加在培养液中的可溶性OPN刺激血管平滑肌细胞(VSMC)后,观察FAK和ILK的磷酸化及FAK与ILK相互作用的变化。结果显示,包被于培养瓶上的OPN通过趋触作用促进VSMC黏附和伸展,接种45min时,黏附细胞数达对照组的2.4倍(P<0.05);OPN的趋触及趋化作用均可诱导FAK磷酸化、ILK去磷酸化并抑制FAK与ILK结合;转染可表达整合素β3亚单位胞内区的表达质粒pEGFP-C3-β3CD能阻断OPN与整合素相互作用所引发的FAK磷酸化及ILK去磷酸化。研究结果表明,OPN的趋触和趋化作用对整合素下游信号分子FAK和ILK的影响是一致的,且这些作用是由整合素β3亚单位胞内区所介导的。