林可链霉菌转化系统的建立

利用基因工程技术改良抗生素生产菌有着广阔的应用前景［１］。值得尝试的是将抗生素生物合成基因片段随机或定向组合导入生产菌中,通过同源重组方式提高生物合成途径中限速步骤相关基因的剂量,以达到提高生产菌发酵单位的目的。此战略被作者称为“基因回转化技术”,并...     

黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8.该质粒通过E.coil ET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接舍转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49 AG1、Tt-49 AG2和Tt-49 AG3.通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点.以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高迭1 000 μg/mL以上.     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。     

玉米浆对林可链霉菌的代谢特性及形态的动态影响

菌丝形态的定量计算表明,添加玉米浆后,菌团核心面积、菌丝面积、圆形因子和边缘菌丝密度等形态学参数均呈上升趋势,菌丝形态得到明显改善,中后期和后期的平均比生长速率增大,菌体的维持代谢和次级代谢保持在较高较稳定水平,有效解决了中后期及后期林可链霉菌的比生长速率为负及林可霉素产量的增长幅度很小的问题。     

糖多孢红霉菌同源片段长度与染色体重组率关系的研究

为了探索同源片段长度与糖多孢红霉菌染色体同源重组率的关系,化学合成或用重叠PCR合成带有突变位点、在突变位点两侧长度为（26bp+27bp）、（500bp+576bp）和（1908bp+1749bp）的同源序列,克隆于糖多孢红霉菌同源重组载体pWHM3后,分别构建了pWHM1113、 pWHM1116和 pWHM1119质粒。以PEG介导转化糖多孢红霉菌A226原生质体,3个质粒分别获得每皿30个、69个和170个转化子,但pWHM1113质粒不能与染色体有效整合,pWHM1116质粒与染色体整合率为转化子的2%,而pWHM1119质粒与染色体整合率达到转化子的19%。 pWHM1116和 pWHM1119质粒均可进行有效的染色体二次重组,将突变位位点引入染色体。因此,同源片段长度为（500bp+576bp）或更长时,可与糖多孢红霉菌染色体进行有效的单重组和双重组。     

同源重组菌株M53的构建及其作为链霉菌通用克隆受体的可行性

为了发展优良的链霉菌宿主系统 ,以带有硫链丝菌素抗性的同源重组葡萄糖异构酶 (GI)缺陷型菌株M10 33XW78,M10 33XW194为出发菌株 ,利用摇瓶、影印和负筛的方法 ,获得一株既无GI活性又对硫链丝菌素敏感的回复菌株 ,命名为淀粉酶链霉菌M5 3.通过染色体PCR检测、酶切图谱鉴定、序列分析等方法 ,确认M5 3含有和M10 33一致的 1 2kb葡萄糖异构酶基因 ,但在结构基因345～ 10 95bp片段内有 17个碱基发生突变 .这说明在染色体内自发同源重组过程中 ,有低频率的突变位点引入 .酶活力测定和SDS PAGE分析表明 ,该突变的GI基因不表达 4 2 5KD葡萄糖异构酶 ,这为M5 3菌株发展成为优良的链霉菌宿主提供了足够的表达空间 .一系列的转化实验也证明了M5 3菌株很可能是一种新型链霉菌克隆受体     

植物基因同源重组研究现状

同源重组是普遍存在的生物学现象,从噬菌体、细菌到真核生物均有存在。它对生物的遗传与变异具有重大影响,一直是生物学家研究的热点。本文从染色体外同源重组、染色体内同源重组以及基因打靶三个方面综述了同源重组在植物方面的研究现状。从分子水平上较详尽的介绍了同源重组发生的机制以及同源重组在生物领域的应用、前景展望及其存在的局限性。     

同源重组技术研究进展

同源重组是近年来迅速发展起来的细胞染色体基因组中某一特殊基因进行定向操作,以便借助转基因动物手段来精确研究基因结构与功能及表达调控的技术。本文对同源重组发生的分子机理,实验设计策略,打靶细胞的筛选和富集方法,近年来在这一领域中所取得的主要成就及应用前景进行了较全面的评述。     

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.     

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶活力调节的研究

对不同氮源生长条件下林肯链霉菌无细胞粗提液中谷氨酰胺合成酶 (GS)的研究结果表明 ,高浓度NH+4阻遏了GS的生物合成。从不同氮源生长条件下林肯链霉菌中分离纯化了GS ,其性质没有差别。以受腺苷化调节的产气克雷伯氏菌GS作对照 ,林肯链霉菌GS没有明显的氨休克作用 ,经蛇毒磷酸二酯酶处理后 ,其活力没有变化。这些结果都说明林肯链霉菌GS不存在腺苷化共价修饰这一调节方式。反馈抑制作用是林肯链霉菌GS的一种重要的调节方式 ,这种抑制作用是以累积的方式进行的 ,这表明各种抑制剂对GS作用位点不同 ,各种抑制剂对GS的抑制作用是相互独立的。由此推测 ,林肯链霉菌GS是一种变构酶。     

林肯链霉菌丙氨酸脱氢酶的纯化和性质

采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52柱层析、亲和蓝柱层析和琼脂糖凝胶Sepharose6B柱层析的方法,分离纯化了林肯链霉菌丙氨酸脱氢酶,用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一组分。以凝胶过滤和聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得该酶的分子量为170000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其亚基分子量为42500,表明林肯链霉菌丙氨酸脱氢酶由四个相同的亚基组成。该酶加氨反应最适pH为9．0,脱氨反应最适pH为9．5,加氨反应和脱氨反应的最适温度均为50℃。加氨反应丙氨酸脱氢酶的表现米氏常数km值为：丙酮酸2．08×10－4mol／L,NH4+2．00×10-2mol／L,NADH2．38×10-5mol／L;脱氨反应的Km为：L-Ala1．43×10-2mol／L;NAD+6．67×10-5mol／L。     

抑制Ligase4或Xrcc6活性增强斑马鱼原始生殖细胞中DNA同源重组的效率

利用斑马鱼作为体内模型, 研究旨在提高斑马鱼原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)中同源重组(Homologous recombination, HR)的效率。首先, 将UAS:mRFP-nos1载体显微注射到Tg (kop:KalTA4) 转基因胚胎中标记转基因PGCs, 结果表明筛选PGCs特异表达mRFP的胚胎能够相对提高转基因的生殖系传递效率。随后建立了PGCs中HR效率的评估体系, 并且证明抑制DNA ligase IV(Lig4)和Xrcc6(曾用名Ku70)的活性不但在全胚胎水平, 而且在PGCs水平都能够显著提高HR的效率。研究表明Tg (kop:KalTA4) 转基因品系是开展HR介导的基因打靶的一个有效平台。       

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

激光辐照的林肯链霉菌（S.lincolnensis）研究

本文首次报导铜蒸气激光辐照林肯链霉菌（Ｓ．ｌｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ）的研究结果,曾获得高产株,最高发酵单位比对照未辐照者提高１５．８％。     

Identification, isolation and sequencing of the recA gene of Streptomyces lividans TK24

Abstract An internal fragment of the recA gene of Streptomyces cattleya was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) employing degenerate oligonucleotide primers. Using this fragment as a hybridization probe, a recA homologous gene could be shown in each tested Streptomyces strain. A 4.4 kb Bam HI fragment which carried the complete recA gene was isolated from Streptomyces lividans TK24. Sequence analysis suggested that the coding region of the recA gene consists of 1122 bp. The highest similarity (∼78%) could be detected to the recA genes of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae . After fusion with an E. coli promoter the S. lividans recA gene could partially complement an Escherichia coli recA mutant.