高产光学纯(R,R)-2,3-丁二醇工程菌株构建与发酵优化

[目的]构建能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇的大肠杆菌工程菌,并进行发酵条件优化。[方法]将来源于多粘芽孢杆菌的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh,来源于阴沟肠杆菌的α-乙酰乳酸合成酶基因bud B和α-乙酰乳酸脱羧酶基因bud A与表达载体p Tr C99A连接,导入大肠杆菌中构建人工合成途径。筛选最适的培养基和发酵条件,提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量、产率和得率。[结果]获得高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的工程菌株GXASB,筛选到最适碳源及其浓度为120 g/L木薯淀粉,最适pH为6.5,最适接种量为10%,在发酵罐中进行同步糖化法发酵,(R,R)-2,3-丁二醇产量达到105.28 g/L,光学纯为99.1%,得率为0.47 g/g,生产强度为1.95 g/(L·h)。[结论]在大肠杆菌中表达基因簇bud B-bud A-bdh能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇,经优化发酵条件后,能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的合成效率。同时工程菌能够利用非粮原料木薯淀粉高效生产(R,R)-2,3-丁二醇,补料发酵产量达到105.28 g/L,为使用廉价原料工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考。     

生物法生产2,3-丁二醇研究进展

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,可广泛应用于多个领域。二战期间由于合成橡胶需要大量1,3-丁二烯,2,3-丁二醇生产空前发展。近年来,由于聚对苯二甲酸丁烯树脂、γ-丁内酯,Spandex弹性纤维及其前体的需求增长,2,3-丁二醇的需求和产量也稳步增长。多年来,生物法生产2,3-丁二醇虽然得到了广泛的研究,但一直没有实现工业化。本文从产生2,3-丁二醇的菌种及2,3-丁二醇的生理意义、代谢途径、旋光异构体的形成机理、影响发酵的因素与产物的提纯等方面对生物法生产2,3-丁二醇进行了综述并提出了生物法生产2,3-丁二醇要解决的几个问题。     

生物法生产2,3-T二醇研究进展

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,可广泛应用于多个领域.二战期间由于合成橡胶需要大量1,3-丁二烯,2,3-丁二醇生产空前发展.近年来,由于聚对苯二甲酸丁烯树脂、γ-丁内酯,Spandex弹性纤维及其前体的需求增长,2,3-丁二醇的需求和产量也稳步增长.多年来,生物法生产2,3-丁二醇虽然得到了广泛的研究,但一直没有实现工业化.从产生2,3-丁二醇的菌种及2,3-丁二醇的生理意义、代谢途径、旋光异构体的形成机理、影响发酵的因素与产物的提纯等方面对生物法生产2,3-丁二醇进行了综述并提出了生物法生产2,3-丁二醇要解决的几个问题.     

基于生物质资源的化工多元醇生物炼制研究进展

介绍了2,3丁二醇、1,2丙二醇和木糖醇等多元醇的主要用途及市场需求,从生产菌株、生产原料、生产方式等方面综述了国内基于生物质资源的2,3丁二醇、1,2丙二醇和木糖醇生物炼制的研究进展。     

芽胞杆菌发酵产2,3-丁二醇的研究进展及展望

综述了近年来利用芽胞杆菌生产2,3-丁二醇(2,3-BD)的研究进展,包括生产菌株的筛选、影响芽胞杆菌发酵2,3-丁二醇的因素、芽胞杆菌2,3-丁二醇代谢途径及调控等方面,并对其研究方向进行了展望。     

pH与溶氧控制对解淀粉芽胞杆菌发酵粗甘油生产2,3-丁二醇的影响

首次利用一株安全菌株解淀粉芽胞杆菌发酵生物柴油副产物粗甘油生产2,3-丁二醇。溶氧和pH是影响微生物法生产2,3-丁二醇的最主要因素。结果表明,发酵过程中不控制pH更有利于2,3-丁二醇合成;采用三阶段控制搅拌转速策略,2,3-丁二醇产量最大值达到?38.1?g/L,生产强度达到1.06?g/(L·h),与恒定转速获得的最好结果相比较,分别提高了14.8%和63.1%。采用脉冲流加发酵时,2,3-丁二醇产量达到71.2 g/L,2,3-丁二醇生产强度达到0.99 g/(L·h),这是目前报道的利用粗甘油合成2,3-丁二醇的最高产量。     

2,3-丁二醇代谢途径关键酶基因敲除对克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的影响

2,3-丁二醇是克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的主要副产物,为减少2,3-丁二醇的产生,利用Red重组技术对克雷伯氏菌2,3-丁二醇合成途径关键酶基因budC和budA进行了敲除。突变株发酵性能实验结果表明,所获得的两株突变株生长性能受到不同程度的影响;budC基因的缺失使菌株1,3-丙二醇产量提高了10%,2,3-丁二醇降低为原来的70%,而budA基因缺失则使菌株无2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产生,但乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的产量较出发菌株都有明显增长。通过进一步对budC基因缺失菌株主要产物分析,推测在该菌中存在2,3-丁二醇回补途径,这一结果为低副产物克雷伯氏菌的改造提供了新依据。     

2，3-丁二醇的发酵及盐析分离工艺

采用克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC 10011）发酵生产2,3-丁二醇,并对2,3-丁二醇的盐析分离工艺进行了考察。通过实验确定了以葡萄糖为底物微氧批式流加发酵的条件,发酵液中2,3-丁二醇和3-羟基丁酮的质量浓度分别为90．98g/L和12．40g/L,2,3-丁二醇的摩尔转化率为82．7％,生产强度达到2．1g/（L·h）。对发酵液中2,3-丁二醇的盐析分离研究表明,K2HPO4和K3PO4对2,3-丁二醇的盐析效果优于K2CO3。当发酵液浓缩70％后,加入质量分数为45％的K,HPO4,2,3-丁二醇的分配系数达到9．10,回收率为79．37％;上相中2,3-丁二醇的质量浓度达到420g／L;此时3-羟基丁酮的分配系数和回收率分别为11．9和83．48％。     

地衣芽胞杆菌WX-02联产聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇培养基的优化

聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇是两种重要的化合物,广泛运用于能源、医药、农业等领域。地衣芽胞杆菌WX-02具有同时合成聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇的能力。优化了地衣芽胞杆菌WX-02联产聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇的发酵培养基,并进行了50 L发酵罐小试放大。分批发酵结果显示,采用优化后的培养基,聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇的产量分别为42.5 g/L和76.13 g/L,比优化前分别提高了26.5%和188%。在联产发酵中聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇的产量能够分别达到单独合成这两种物质的水平,为工业化联产聚γ谷氨酸和2,3-丁二醇奠定了基础。     

Klebsiella pneumoniae CICC10011发酵产2,3-丁二醇的工艺研究

2,3-丁二醇应用广泛,是一种潜在的平台化合物,可以用于替代传统平台化合物-四碳烃。基于能源安全及绿色环保的需求,生物炼制制备2,3-丁二醇受到人们的青睐。与化学法相比,生物炼制制备2,3-丁二醇具有明显的优势。因此,开发合适的2,3-丁二醇发酵工艺是实验室研究的重点。针对菌种Klebsiella pneumoniae CICC10011,研究人员对菌种发酵产2,3-丁二醇的性质进行了初步考察,并通过控制不同的发酵条件,研究了pH、通空气量和转速在发酵过程中对菌种代谢的影响,从而确定了菌种发酵产2,3-丁二醇的工艺条件。发酵过程中,pH、通空气量以及转速均采用两段调控。在前12h菌种生长阶段,控制pH 6.8,通空气量1.0vvm,转速400r/min,转发酵之后控制发酵条件为pH 6.0,通空气量0.5vvm,转速300r/min。     

生物发酵法生产1,3-丙二醇和2,3-丁二醇

1,3-丙二醇(1,3-PDO)和2,3-丁二醇(2,3-BDO)是工业生产中常见的二醇,可以直接由可再生原料经生物转化生成,在化学、能源等方面具有广泛的用途。本文综述并讨论了微生物发酵法生产这两种二醇的进展,重点介绍了生产菌株的改造及发酵过程的优化。     

地衣芽孢杆菌高产2,3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

目前2,3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌,对人类健康和环境具有一定威胁。从牛奶样品中分离到1株产2,3-丁二醇的芽孢杆菌127-7,分析其16S rRNA基因序列,确定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。进一步对菌株127-7进行紫外诱变,筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。摇瓶发酵结果显示,突变株BL41的2,3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。对发酵副产物分析发现,不控制发酵液pH可以显著降低乳酸产量,2,3-丁二醇产量在72 h达到81.4 g/L。进一步调整补糖策略,维持最低残糖浓度为30 g/L,菌株BL41产2,3-丁二醇83.4 g/L,最高产率为1.9 g/L·h,发酵时间缩短至46 h。结果表明,地衣芽胞杆菌BL41可以作为候选菌株,用于工业规模2,3-丁二醇的生产。     

一株以葡萄糖为底物产2,3-丁二醇微生物菌株的筛选及鉴定

从自然界中筛选出一批以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇的菌株,经初步发酵测定发酵液中2,3-丁二醇含量,其中菌株6-7的2,3-丁二醇产量最高达49.6g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16SrDNA序列分析,比对结果表明,菌株6-7与Bacillus subtilis strain BIHB332相似性达99%。在细菌分类学上属于枯草芽孢杆菌属,将其命名为Bacillussubtilis6-7。其特点是属于环境友好和食品安全型菌株,因此,利用Bacillus subtilis6-7生产2,3-丁二醇具有良好的工业应用价值。     

Evonik与BioAmber共同开发以生物琥珀酸为原料制造的催化剂

2012年7月24日，德国EvonikIndustries公司宣布，旗下的催化剂事业部将与美国BioAmber公司长期合作，共同开发、制造以生物琥珀酸为原料，生产1，4-丁二醇（1．4．butanediol，BDO）、四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）及y-丁内酯（Gamma．Butyrolactone，GBL）所必需的催化剂。     

Effects of different organic acids on 2,3-butanediol production by Serratia marcescens

考察了不同的短链有机酸对粘质沙雷氏菌合成2,3-丁二醇的影响,结果表明乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、延胡索酸和柠檬酸均能在一定程度上提高2,3-丁二醇的产量,其中乙酸的效果最为明显,在基础培养基中添加6 g/L乙酸,与对照相比,2,3-丁二醇的产量提高了91.06％,此外菌体干重也提高了58.28％.为了揭示其中的调控机制,构建了启动子:lacZ融合报告载体,lacZ活性测定显示六种有机酸均可提高报告基因β-半乳糖苷酶的表达,其中乙酸提高β-半乳糖苷酶活性近4倍,暗示六种有机酸促进2,3-丁二醇的合成可能与诱导该合成途径相关基因的表达有关.     

代谢工程改造多粘芽孢杆菌及合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇

(R,R)-2,3-BD是一种重要的四碳平台化合物,在液晶材料、高附加值手性化合物,尤其是不对称合成光学纯药物等方面有天然优势.将来源于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DSM 365的α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase)基因 alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)基因alsD和(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase)基因R,R-bdh与表达载体pMA5连接,导入多粘芽孢杆菌P.polymyxa DSM 365中加强(R,R)-2,3-丁二醇的主代谢途径,构建可高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的多粘芽孢杆菌工程菌株DM-5.利用工程菌株DM-5补料分批发酵60 h,(R,R)-2,3-丁二醇产量达54.91 g/L,得率为0.52 g/g,生产强度为0.92 g·L-1·h-1,与野生菌株相比(R,R)-2,3-丁二醇产量增加19.66％,且副产物甲醇浓度不变,乙醇、乙偶姻积累下降.本研究结果表明,在多粘芽孢杆菌中过量表达关键基因alsS、alsD和R,R-bdh 能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量和生产强度,为多粘芽孢杆菌的代谢工程改造和工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考.     

玉米秸秆水解液发酵联产氢气与2,3-丁二醇的初步研究

选用实验室自行筛选的Klebsiella pneumoniae ECU-15,进行了玉米秸秆水解液发酵联产氢气和2,3-丁二醇的初步研究。结果表明:以葡萄糖为碳源时,两目标产物随培养条件的改变呈现相同的变化趋势,且最佳发酵温度为37℃,最佳pH为6.0,最佳初始糖浓度为30 g/L;不同比例葡萄糖/木糖为混合碳源时,均能实现氢气和2,3-丁二醇的联产过程,但随着木糖含量的增加,细胞产量、氢气产量和2,3-丁二醇的产量都有所下降,并且木糖的存在会降低葡萄糖的消耗速率;实验最后以玉米秸秆水解液和同比例模拟合成培养基为底物,初步探明了该菌株利用水解液发酵联产氢气和2,3-丁二醇的可行性,最终氢气产量为0.65 v/v,产氢得率为0.43 mol/mol sugar;2,3-丁二醇产量为5.05 g/L,得率为0.82 mol/mol sugar。     

产2,3-丁二醇高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌转录组学分析与发酵优化

选育高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌并对其进行转录组学分析与产2,3-丁二醇发酵条件的优化。首先通过适应性进化定向筛选出了具有高木糖耐受能力和2,3-丁二醇产量提高的肺炎克雷伯氏菌(KP2),然后对其进行转录组学分析与发酵条件优化。结果显示,筛选出的高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌木糖的转化率提高了174.5%,2,3-丁二醇的产量提高了227%。转录组分析结果表明亲本菌株KPG和KP2菌株差异表达基因中有242个基因上调和263个基因下调。Pathway分析表明,转录水平的变化主要表现在信号转导、碳水化合物代谢、能量代谢和其它物质代谢等。在1L反应器中,初始木糖浓度120 g/L时最优发酵条件为:温度35℃,转速230 r/min,通气量0.7 L/min,最适pH值5.9。在最优条件下,2,3-丁二醇产量达43.75 g/L,相比优化前提高了32.7%。本研究获得了高效利用木糖生产2,3-丁二醇的菌株,对表型变化产生的机理在分子水平上进行阐述,并得到了最优的发酵条件,结果可以为2,3-丁二醇的生物转化提供参考,对2,3-丁二醇的生物法生产具有一定的指导意义。     

细菌3-羟基丁酮及氧化还原产物代谢的研究进展

3-羟基丁酮及氧化还原产物是重要的4碳平台化合物,以糖质原料为底物的生物法制备是当今研究与生产的主流。介绍了3-羟基丁酮及氧化还原产物2,3-丁二醇、丁二酮产生的主要细菌,这些细菌积累3-羟基丁酮及氧化还原产物的代谢途径,主要的代谢及调控方式,代谢关键酶:乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、2,3-丁二醇脱氢酶的结构与功能等国内外研究进展;并对3-羟基丁酮及氧化还原产物细菌代谢、发酵制备的未来研究提出了展望。     

乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛对产酸克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇的影响

为了解产酸克雷伯氏菌对木质纤维素水解液中主要抑制物的耐受和代谢,考察了产酸克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇(2,3-butanediol,2,3-BDO)过程中对3种发酵抑制物乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural HMF)的耐受以及抑制物浓度的变化,检测了糠醛和HMF的代谢产物.结果表明:产酸克雷伯氏菌对乙酸、糠醛和HMF的耐受浓度分别为30 g/L、4 g/L和5 g/L.并且部分乙酸可作为生产2,3-丁二醇的底物,在0～30 g/L浓度范围内可提高2,3-丁二醇的产量.发酵过程中产酸克雷伯氏菌可将HMF和糠醛全部转化,其中约70％HMF被转化为2,5-呋喃二甲醇,30％HMF和全部糠醛被菌体代谢.研究表明在木质纤维素水解液生产2,3-丁二醇的脱毒过程中可优先考虑脱除糠醛,一定浓度的乙酸可以不用脱除.