马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利用RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHR-I基因(potato Phytophthora infestans-induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA。序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinI有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83％和81％)。Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2、3个拷贝。对其诱导表达模式研究表明：晚疫病病原菌接种36h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCI浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达。该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关。     

小麦BBC1基因cDNA的克隆与分析

从小麦(Triticum aestivum L．)中克隆了一个BBC1基因的cDNA。分析结果表明,该基因编码一亲水多肽,富含丙氨酸、赖氨酸、精氮酸和谷氦酸。该基因的转录受低温调控。在小麦基因组中,BBC1基因以一个小家族的形式存在。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA

为克隆马铃薯晚疫病抗性相关基因,深入研究马铃薯晚疫病抗性机制,应用SMART LD—PCR技术,以晚疫病菌混合小种诱导48h的水平抗性马铃薯(Solanum tuberosum L．)(R—gene—free)叶片为材料,构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的cDNA文库。为提高克隆全长cDNA的效率,将cDNA文库与RACE技术结合,依据本实验室得到的病原诱导表达片段测序结果,在其内部设计两个特异引物,与文库载体臂上的通用引物配对,以文库噬菌体DNA为模板,用高保真PCR分别扩增出cDNA5′端与3′端,从而简便、快捷地得到全长cDNA序列。采用此方法,在马铃薯中克隆了一个受晚疫病菌诱导表达的cDNA,该cDNA长904bp,5′端有29bp的非翻译区,3′端具有完整的polyA尾,包含一个678bp的完整开放阅读框架,编码226个氨基酸(GenBank登录号：AY 185207)。BLAST检索发现其氨基酸序列与烟草一个新的病程相关蛋白基因NtPRp27具有90％的同源性,在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。Northern杂交结果表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、机械伤害和渗透胁迫都能诱导该基因表达。该基因可能是马铃薯一个新的病程相关蛋白基因。     

马铃薯StAP1基因的分子克隆与表达分析

采用RT-PCR方法从马铃薯品种‘Désirée’中克隆了StAP1cDNA序列（GenBank登录号GU220568）。该基因cDNA开放阅读框长度为735bp,编码一个由244个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为28.57kDa,理论等电点为8.32。StAP1蛋白含有1个高度保守的MADS结构域,与烟草NAP1具有较高一致性。组织表达分析显示,StAP1在马铃薯植株的顶芽、花和叶中有较高水平的转录表达,在块茎中有微量表达。利用反义StCOL转基因马铃薯植株进一步分析表明,StAP1的表达受StCOL的调控。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

马铃薯Y病毒p1基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)p1基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0．83kb的目的条带,测序结果表明为PVY p1基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。     

大鼠FMR1同源基因cDNA的克隆,测序与选择剪接的初步分析

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从新生大鼠脑组织总ＲＮＡ扩增大鼠ＦＭＲ１同源基因的ｃＤＮＡ片段,克降至ｐＵＣ１８质粒中进行序列分析。获得从终止密码子起共１６８１ｂｐ的编码序列,尚缺少约２００ｂｐ的５‘序列。所克隆的这部分大鼠ＦＭＲ１ｃＤＮＡ,不含有对应于人ＦＭＲ１基因的外显子１２及外显子１７第一和第三剪接受点之间的序列,提示大鼠ＦＭＲ１基因也有选择剪接表达。     

Potato StMPK7 is a downstream component of StMKK1 and promotes resistance to the oomycete pathogen Phytophthora infestans

A cascade formed by phosphorylation events of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) takes part in plant stress responses. However, the roles of these MAPKs in resistance of potato (Solanum tuberosum) against Phytophthora pathogens is not well studied. Our previous work showed that a Phytophthora infestans RXLR effector targets and stabilizes the negative regulator of MAPK kinase 1 of potato (StMKK1). Because in Arabidopsis thaliana the AtMPK4 is the downstream phosphorylation target of AtMKK1, we performed a phylogenetic analysis and found that potato StMPK4/6/7 are closely related and are orthologs of AtMPK4/5/11/12. Overexpression of StMPK4/7 enhances plant resistance to P. infestans and P. parasitica. Yeast two-hybrid analysis revealed that StMPK7 interacts with StMKK1, and StMPK7 is phosphorylated on flg22 treatment and by expressing constitutively active StMKK1 (CA-StMKK1), indicating that StMPK7 is a direct downstream signalling partner of StMKK1. Overexpression of StMPK7 in potato enhances potato resistance to P. infestans. Constitutively active StMPK7 (CA-StMPK7; StMPK7^{D198G, E202A}) was found to promote immunity to Phytophthora pathogens and to trigger host cell death when overexpressed in Nicotiana benthamiana leaves. Cell death triggered by CA-StMPK7 is SGT1/RAR1-dependent. Furthermore, cell death triggered by CA-StMPK7 is suppressed on coexpression with the salicylate hydroxylase NahG, and StMPK7 activation promotes salicylic acid (SA)-responsive gene expression. We conclude that potato StMPK7 is a downstream signalling component of the phosphorelay cascade involving StMKK1 and StMPK7 plays a role in immunity to Phytophthora pathogens via an SA-dependent signalling pathway.     

马铃薯非共生血红蛋白基因StHb1的克隆及表达

采用RT-PCR技术成功分离了马铃薯StHb1基因序列.经半定量RT-PCR分析表明,StHb1基因的表达在抗性品种(陇薯三号)和感性品种(荷兰十五)块茎中均受致病疫霉的侵染所抑制;StHb1基因在正常生长的马铃薯块茎组织中表达量最高;外源NO和H2O2的作用可明显地抑制StHb1基因的表达,但在抗性品种中该基因受抑制的程度低于感性品种.上述试验结果暗示了StHb1基因与马铃薯对致病疫霉侵染的抗性应答具有一定的相关性.     

利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因

以晚疫病病原菌混合小种接种处理48h的马铃薯水平抗性材料(R-gene-free)叶片为目的材料,以未处理材料作为对照,用抑制差减杂交技术构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的差减文库。应用反向Northern技术对840个克隆进行斑点杂交筛选,筛选出150个病原诱导后信号明显增强的克隆。26个片段测序结果表明：部分片段基因功能与抗病性明显相关。7个差异表达片段与GenBank EST数据库中已有晚疫病原诱导马铃薯叶片得到的EST有很高同源性(达95％～100％);部分片段核苷酸或氨基酸序列分别与番茄、烟草、拟南芥等的EST序列或氨基酸序列有较高同源性;另有4个基因片段在GenBank EST数据库中未找到明显的同源序列,可能为新发现的基因片段。     

甘薯草甘膦抗性基因EPSPS克隆和序列分析

EPSPS基因编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶,该酶是芳香族氨基酸合成的关键酶,该基因在细菌、真菌、藻类和植物中被广泛克隆和研究。EPSPS酶是草甘膦除草剂的靶点酶,过量表达EPSPS基因可以提高作物的草甘膦抗性。该研究根据甘薯基因组数据库设计引物,以‘广薯87’为材料提取RNA,通过RT-PCR方法扩增甘薯IbEPSPS基因,测序后进行生物信息学分析和表达分析。结果表明:(1)成功克隆获得甘薯IbEPSPS基因,该基因全长CDS为1569 bp,编码522个氨基酸,其中在第98~113、173~183位氨基酸序列具有2个EPSPS的保守结构域。(2)系统进化树分析结果表明,甘薯IbEPSPS基因与三裂叶薯(Ipomoea triloba)、打碗花(Calystegia hederacea)、田旋花(Convolvulus arvensis)和牵牛(Ipomoea nil)聚在一类,其中与三裂叶薯的亲缘关系最近。(3)实时荧光定量PCR分析结果表明,甘薯IbEPSPS基因在茎、叶和茎尖表达量较高,同时受到草甘膦胁迫后IbEPSPS基因表达量提高。该研究结果为进一步探讨甘薯IbEPSPS基因的功能及甘薯对草甘膦的耐药性机制奠定了基础。     

The R1 gene for potato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes

Late blight caused by the oomycete Phytophthora infestans is the most destructive disease in potato cultivation worldwide. New, more virulent P. infestans strains have evolved which overcome the genetic resistance that has been introgressed by conventional breeding from wild potato species into commercial varieties. R genes (for single-gene resistance) and genes for quantitative resistance to late blight are present in the germplasm of wild and cultivated potato. The molecular basis of single-gene and quantitative resistance to late blight is unknown. We have cloned R1, the first gene for resistance to late blight, by combining positional cloning with a candidate gene approach. The R1 gene is member of a gene family. It encodes a protein of 1293 amino acids with a molecular mass of 149.4 kDa. The R1 gene belongs to the class of plant genes for pathogen resistance that have a leucine zipper motif, a putative nucleotide binding domain and a leucine-rich repeat domain. The most closely related plant resistance gene (36% identity) is the Prf gene for resistance to Pseudomonas syringae of tomato. R1 is located within a hot spot for pathogen resistance on potato chromosome V. In comparison to the susceptibility allele, the resistance allele at the R1 locus represents a large insertion of a functional R gene.     

致病疫霉有性生殖诱导及F1代遗传多样性

致病疫霉Phytophthora infestans为马铃薯晚疫病的重要病原菌。通过从昆明市寻甸县采集110P和H-6两株致病疫霉,明确其染色体倍性、交配型、线粒体单倍型、毒性和甲霜灵敏感性,经对峙培养,利用改良的卵孢子萌发方法获得有性生殖F1代群体POP1（60株）,并对POP1进行表型和基因型测定。结果表明：冷冻处理24h为最佳条件,卵孢子萌发率达5.09%±0.15%;POP1的交配型、毒性和甲霜灵敏感性均发生了分离,其中交配型分离比为A1:A2:A1A2:自育型（SF）=16:5:17:22,毒性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=11:49,甲霜灵敏感性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=2:58;3个表型的分离均偏离孟德尔单基因显性遗传特点。基于8对SSR多态性引物对POP1基因型分析表明,遗传相似系数为0.98时,可将所有菌株分为14个基因型;遗传相似系数为0.95时,可将POP1分为6个分支,其中优势群体为S1,占分离群体的61.67%。关联分析进一步表明,8对SSR所代表的基因型和几个重要表型有显著相关性（R2=0.6667）。本研究建立了高效的致病疫霉卵孢子萌发体系,解析了有性生殖后代群体遗传结构特点,为深入探索致病疫霉的变异规律及病害流行趋势提供了理论基础。     

寄生疫霉parA1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据已报道的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)parA1基因的序列设计引物,从4株寄生疫霉中国菌株(3株来自烟草,1株来自刺槐)中克隆到此基因并进行了重组表达。序列分析表明4株寄生疫霉parA1基因序列高度保守。对表达载体pET30a(+)双酶切,构建表达Parasiticein蛋白的表达载体pETeli,用CaCl\-2法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,通过诱导在大肠杆菌中进行非融合表达,表达产物在烟草上引起过敏性反应。性质测定表明,表达产物有一定的耐热性,并对蛋白酶K敏感。