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甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究 总被引:6,自引:0,他引:6
用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86~8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%~20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为(68.6 ± 5.1)μmol/L,kcat为(45 ± 6 )S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为(59.5 ± 6.0)μmol/L,kcat为(8 ± 1) S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。 相似文献
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短时间超速离心(4h)结合抗人 apo(a)免疫亲和层析分离纯化了人血浆 Lp (a),所得制品经聚丙烯酰胺凝胶电泳和 double-decker 火箭免疫电泳等鉴定为纯品.与国外常规分离 Lp (a)的方法相比,该法具有简便,经济,提纯周期短和 Lp (a)纯度高等优点,得率提高一倍以上. 相似文献
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人白细胞匀浆中的LTA4H经硫酸铵分段盐析,DEAE-纤维素柱层析,Sephadex柱层析和HpLCmono-Q阳离子交挟柱层析,再经羟基磷灰石柱纯化,得到其纯度可达90—95%的产物。酶活性为212LTB2nmol·mg-1·min-1。较纯化前活性提高350倍。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示酶的分子量为68000—70000的单体蛋白质。与以前报道人红细胞LTA4H不同。 相似文献
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假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
从最近分离到的有机磷农药降解菌Pseudomonassp. WBC3中获得了甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase, MPH,EC 3183)。该酶在48h的培养物中分布比例分别为:上清液2.1%, 胞内862%和胞间质11.7%,说明MPH为胞内酶。经过Cmsepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得电泳纯的酶。SDSPAGE和凝胶过滤层析表明,该酶为单体蛋白,分子量约为34kD。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶,但最适底物为甲基对硫磷。在pH9~12范围,酶表现较高活力水平,最高活力的反应温度为40℃。根据各类金属离子和鳌合剂对酶活的影响,推测MPH为金属酶。 相似文献
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节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶(HyuH)与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法:将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果:SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论:得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。 相似文献
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采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。 相似文献
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米曲霉LY-128的培养物经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-100 凝胶过滤, DEAE-Sephrose CL-6B 和Sephadex G-100层析手段,获得了电泳纯的广谱有机磷农药水解酶。通过SDS-PAGE 和IEF电泳测得其分子量为62 kDa, 等电点为pH 5.2。该酶的最适反应温度为45℃,最适 pH 6.8, 在50℃以下及pH6.0~9.5 范围内活性稳定。Hg2+、Fe3+、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2+、 巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用。底物的专一性实验表明,该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药。以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为52祄ol、236 祄ol; Vmax分别为317祄ol min-1 mg-1、179 祄ol min-1 mg-1;Kcat分别为1152 s-1、650 s-1。 相似文献
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米曲霉LY-128的培养物经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-100凝胶过滤,DEAE-Sephrose CL-6B和Sephadex G-100层析手段,获得了电泳纯的广谱有机磷农药水解酶.通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为62 kDa,等电点为pH 5.2.该酶的最适反应温度为45℃,最适pH 6.8,在50℃以下及pH6.0~9.5范围内活性稳定.Hg2+、Fe3+、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2+、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用.底物的专一性实验表明,该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药.以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为52μmol、236μmol;Vmax分别为317μmol min-1 mg-1、179 μmol min-1 mg-1;Kcat分别为1152 s-1、650 s-1. 相似文献
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A SIMPLE METHOD FOR PRODUCING ANAEROBIOSIS 总被引:4,自引:3,他引:1
C. L. HELLER 《Journal of applied microbiology》1954,17(2):202-202
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