病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默。发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录。利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默。进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默。对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加。     

DNA甲基化与植物转基因沉默研究进展

基因沉默现象已成为转基因植物商品化生产的严重阻碍。本文就DNA甲基化的作用机制及由其引起转基因沉默的研究作了简要综述。另外,结合基因表达的抑制因素,对如何消除DNA甲基化,促使外源基因高效表达的策略进行了初步探讨。     

DNA甲基化与植物转基因沉默研究进展

基因沉默现象已成为转基因植物商品化生产的严重阻碍。本文就DNA甲基化的作用机制及由其引物转基因沉默的研究作了简要综述,另外,结合基因表达的抑制因素,对如何消除DNA甲基化,促使外源基因高效表达的策略进行了初步探讨。     

植物转基因沉默与病毒抗性

对植物基因沉默的机制及其在植物抗病毒基因工程中的应用作了综述.植物转基因沉默是转基因植株中普遍发生的一种现象,引起植物转基因沉默的原因是多方面的,但主要涉及转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默.植物对病毒的抗性机制在某些方面与基因沉默有相似之处.     

转基因植物转录后基因沉默的克服对策

人们对植物进行遗传转化的目的是让转基因在植物基因组中能够稳定整合并在当代及其子代中能够有效、稳定的表达 ,但是由于多种因素的影响 ,转基因在植物中的表达并不很理想。自从 1 986年Ｐｅｅｒｂｏｔｔｅ报道转基因烟草中转基因发生沉默以来 ,很多学者也都发现大量的转基因植株不能正常表达[1]。经过多年的研究 ,发现导致转基因沉默的机理有多种 ,根据其作用机理和水平的不同 ,人们通常把转基因沉默分为[2 ,3]:位置依赖性基因沉默 (Ｐｏｓｔｉｏｎ -ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ,ＰＤＧＳ)、转录水平的基因沉默 (Ｔｒ…     

植物转基因沉默研究进展、对策及应用

转基因沉默 (ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)是导入并整合进受体基因组中的外源基因在当代转化体或其后代中表达受到抑制的现象。自Ｐｅｅｒｂｏｌｔｅ在 1986年首次报道发现转基因沉默现象以来 ,相关报道不断发表。如今 ,转基因沉默现象已成为遗传转化技术实用化 ,商品化过程中的巨大障碍。从九十年代开始 ,人们就致力于转基因沉默方面的研究。随着研究的不断深入 ,转基因沉默的各种机理不断被揭示 ,并研究出相应的对策。1.植物转基因沉默研究进展转基因沉默的各种机理都涉及到各种核酸之间的相互作用 ,包括转录水平的基因沉默 (ｔ…     

植物转基因沉默与消除

植物基因工程研究是希望获得高稳定表达的转基因植株,而转基因沉默现象却限制了转基因植物的应用前景,基因沉默的机制是多方面的,包括转基因多拷贝之间的异位配对,转基因序列的甲基化,插入位点在染色体结构上的改变及转录后的衰退调控等,研究外源基因的失活原因及寻找相应的策略控制失活,对于植物基因工程的发展有着重要的意义。     

转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用

自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来 ,很多学者对该现象进行了广泛的研究 ,认为其作用机制有三种 :位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究 ,通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点 ,并对其机制提出了一些假说。最近 ,人们还发现转录后水平基因沉默与植物抗病毒能力有联系。本文对转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用方面的进展作了综述     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白的转基因烟草的抗病性研究

将马铃薯Ｙ病毒中国分离物（ＰＶＴ－Ｃ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因,在土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４的介导下,转化烟草生产品种ＮＣ８９,获得了６个烟草株系。通过抗性分析发现,６个株系中有一个株系在２００μｇ／ｍｌＰＶＹ－Ｃ的攻毒下,仍未发病,分子检测发现,转基因植物中抗性产生的程度并不是同ＰＶＹ－Ｃ外壳蛋白的表达水平成正相关。     

植物DNA甲基化

DNA甲基化是造成植物转录水平基因沉默的主要原因。从DNA甲基化的发生机理,DNA甲基化抑制基因转录以及调控基因转录的方式简要地介绍了真核生物中DNA甲基化的功能和调控机制方面的一些研究进展。     

马铃薯单双三价抗病毒基因表达载体的构建

马铃薯Y病毒(PVY)、X病毒(PVX)和卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化的主要原因,严重危害我国的马铃薯生产。PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。国外科学家通过在马铃薯植株体内表达病毒外壳蛋白(CP)基因来减缓病毒病害的发生已取得相当的成功。 我们从河北省坝上地区农科所试验田中采集PLRV感病材料Burbank及87-1,参照文献提取病毒RNA并以其为模板,反转录合成cDNA。根据PLRV澳大利亚分离物已发表的序列,设计并     

病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象,是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制。现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS无需构建转基因植株,而且具有操作简便、获得表型快速等优点,目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。该文就VIGS技术的作用机理、主要操作规程、在植物基因功能研究方面的应用以及存在的问题进行综述。     

Transgenic Potato with PVY Coat Protein Gene and Its Small-Scale Field Test

Potato virus Y (PVY) infection may cause a severe yield depression up to 80%. To develop the potato (Solanum tuberosum L. ) cultivars that resist PVY infection is very crucial in potato production. The authors have been cloned the coat protein gene of PVY from its Chinese isolate. A chimaeric gene containing the cauliflower mosaic virus 35S promoter and PVY coat protein coding region was introduced into the potato cultivars “Favorita”, “Tiger head” and “K4” via Agrobacterium tumefaciens. Results from PCR and Southern blot analysis confirmed that the foreign gene has integrated into the potato chromosomes. These transgenic potato plants were mechanically inoculated with PVY virus (20 mg/L). The presence of the virus in the potato plants was determined by ELISA and method of back inoculation into tobacco. The authors observed a drastic reduction in the accumulation of virus in some transgenic potato lines. Furthermore, some transgenic potato lines produced more tubers per plant than the untransformed potato did, and the average weight of these transgenic plant tubers was also increased. In the field test, the morphology and development of these transgenic potato plants were normal, 3 transgenic lines of “Favorita” exhibited a higher yield than the untrasformed virus-free potato with an increase ranged from 20% to 30%. From these transgenic lines, it will be very hopeful to develop a potato cultivar which not only has a significant resistance to PVY infection, but also a good harvest in potato production.     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

病毒诱导烟草的基因沉默

病毒诱导基因沉默是利用RNA介导病毒防卫机制的一项技术。构建含有目的基因片段的人工改造病毒载体,通过农杆菌侵染导致植物内源目的基因沉默。为建立病毒诱导基因沉默体系,选用烟草脆裂病毒（TRV）和烟草为实验材料。构建了八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS）的基因沉默病毒载体,病毒载体侵染结果显示目的基因PDS沉默导致烟草幼苗出现光漂白现象。采用RT-PCR的方法检测目的基因PDS的沉默效果,结果显示PDS基因mRNA被显著降解。该体系的建市有利于将来对植物基因进行高通量功能分析。     

Expression of Potato Virus Y Coat Protein Gene in Transgenic Potato

Potato virus Y (PVY) N coat protein (CP) coding sequence was cloned into a plant expression vector pMON316 under the CaMV 35S promoter. Leaf discs of potato (Solanum tuberosum) were used to Agrobacterium-mediated gene transfer. A large number of regenerated putative transgenic plants were obtained based on kanamycin resistance. Using total DNA purified from transgenic plants as templates and two oligonucleotides synthesized from 5' and 3' of the PVY coat protein gene as primers, the authors carried out polymerase chain reaction (PCR) to check the presence of this gene and obtained a 0. 8 kb specific DNA fragment after 35 cycles of amplification. Southern blot indicated that the PCR product was indeed PVY CP gene which had been integrated into the potato genome. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of our transgenic plants showed that CP gene was expressed in at least some transgenic potato plants.     

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT－PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系（PVY^N）的可翻译和不可翻译外壳蛋白（CP）基因,并分别插入pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的基因转化方法,将可翻译和不可翻译的PVY^N-CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中,得到抗卡那霉素的再生植株,对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的95％和98％。攻毒实验表明,两种类型的转基因烟草对PVY^N的抗病性具有相似性,其表现型为：免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明,在表达不可翻译PVY^N－CP基因的转基因植株内 以CP蛋白,而在导入可翻译的PVY^N-CP基因的植株内检测到了CP蛋白,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明,表达可翻译与不可翻译PVY^N-CP基因的转基因烟草对PVY^N的抗病性均为RNA介导的抗病性。