IκBα缺失突变体真核表达载体的构建、表达及其生物活性检测

旨在构建缺失N端前36个氨基酸的IκBα突变体真核表达载体,并对其表达及生物学活性进行检测.从人源子宫颈癌细胞HeLa中提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得IκBα缺失突变体的cDNA,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中,构建重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN.通过PCR方法、NcoⅠ酶切以及核酸测序分析对其进行鉴定;采用Western Blot检测IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中的表达.将pcDNA3.1-IκBαΔN和pNF-κB-Luc共转染 HeLa细胞,经TNF-α诱导后,利用萤光素酶报告系统来检测重组载体对NF-αB的抑制活性.结果表明,经PCR方法、NcoⅠ酶切鉴定及核酸测序分析后,证实成功构建了重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN;IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中高效表达,并对NF-κB有显著的抑制活性(P＜0.01).因此,真核表达载体pcDNA3.1-IκBαΔN构建成功,为一步研究NF-κB信号传导通路及其相关疾病提供有效的分子工具.     

IKKα的研究进展

IκB激酶(IKK复合体)是NF-κB信号转导途径成员之一,包括3个亚基:催化亚基IKKα、IKKβ和调节亚基IKKγ。无刺激时,NF-κB与抑制蛋白IκB家族的一个成员结合,或者与无活性前体(如p100)结合而以无活性形式存在。在外界信号如TNF-α或淋巴毒素β等刺激下,经过复杂的信号转导,IKK复合体被激活,导致IκB和(或)p100发生磷酸化,结果NF-κB被释放出来,进入细胞核内激活靶基因。最新研究发现在TNF-α刺激下,IKKα可直接进入细胞核内,通过催化组蛋白H3磷酸化进而激活特定NF-κB应答基因的表达。IKKα是首次发现的信号转导途径中直接进入细胞核内调节基因表达的上游成分,为NF-κB信号转导途径的研究开辟了新的道路。     

乳酸调控大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的NF-κB信号通路

目的探讨内毒素（LPS）刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMMVECs）后,乳酸（LA）调控NF-κB信号通路中磷酸化IκBα和NF-κB p65蛋白表达情况,肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）mRNA表达情况,阐明乳酸发挥作用的最佳时间及其调控NF-κB信号通路的部位。方法提取RIMMVECs总蛋白和总RNA,用Western blotting检测NF-κB p65、IκBα及p-IκBα蛋白表达水平,用real-time PCR对TNF-α和IL-6 mRNA进行定量检测。结果乳酸能降低LPS诱导RIMMVECs分泌的TNF-α和IL-6 mRNA表达水平,并分别于24 h和3 h下调效果最明显;乳酸能抑制IκBα磷酸化及NF-κB转录活性,并于4～8 h达到最佳效果;乳酸发挥作用部位是抑制信号通路中IκBα磷酸化。结论乳酸通过抑制IκBα磷酸化而阻断NF-κB的激活,抑制下游炎性因子表达,进而发挥出很好的预防炎症效果。     

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型（CVB5）是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白（NSP）可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)NFκB抑制因子α基因PaIκBα克隆及表达

核转录因子κB抑制因子α(IκBα)是NFκB/IκB信号传导通路的重要成员,参与机体抗细菌感染等多种免疫反应,可通过蛋白质间的相互作用结合核转录因子NFκB,从而调控生物体多种免疫基因表达。该研究采用RACE技术从香鱼中克隆得到核转录因子κB抑制因子PaIκBα基因的cDNA全长序列(1341bp,GenBank Accession No.JN801027),开放阅读框ORF为936bp,编码311个氨基酸,5’非编码区为64bp,3’非编码区为341bp。生物信息学分析表明,香鱼IκBα蛋白的序列中包含5个保守的锚蛋白重复序列,N末端含有信号诱导蛋白,C末端含有PEST序列。同源性比对结果表明,香鱼IκBα蛋白与胡瓜鱼IκBα的同源性最高,为95%;其次是大西洋鲑、虹鳟、尼罗罗非鱼和鳜鱼等,同源性分别为76%、75%、70%和68%。系统进化树分析表明,香鱼IκBα蛋白与胡瓜鱼、虹鳟、尼罗罗非鱼、鳜鱼和大西洋鲑等亲缘关系最近。RT-PCR分析表明,PaIκBα基因在香鱼肝脏、肾脏、脾脏和鳃中表达水平较高,其次是肠、脑和肌肉,在心脏中表达极少。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophil)感染香鱼后,PaIκBα基因表达增强,感染24h达最大值,表明PaIκBα基因在香鱼受到嗜水气单胞菌刺激的免疫过程中可能发挥着重要作用。     

STEMI患者血浆和血小板CCL2水平及其对血小板NF-κB信号通路的影响

目的:研究急性ST抬高型心肌梗死(STEMI)患者血浆和血小板中趋化因子CCL2的水平及其对血小板核因子κB(NF-κB)信号通路中P65和IκBα的影响。方法:选择2015年10月至2016年1月沈阳军区总医院CCU收治的STEMI患者50例及同期正常对照人群50例,采用ELISA检测其血浆中CCL2水平,western blot检测其血小板中CCL2和CCR2的表达;western blot检测经CCL2刺激后血小板中p P65和IκBα表达,进而应用CCR2拮抗剂RS201895及NF-κB信号通路抑制剂Bay11-7082预处理血小板,再应用CCL2刺激血小板,检测p P65和IκBα表达。结果:STEMI患者血浆CCL2浓度为222±98 pg/m L,正常对照组血浆CCL2浓度为162±24 pg/m L,较STEMI组显著降低,差异存在统计学意义(P0.01)。STEMI患者血小板中CCL2和CCR2的表达较正常对照组明显增加(P0.01)。经CCL2刺激后,血小板中p P65水平升高,IκBα水平降低(P0.01);在CCL2刺激血小板之前,应用RS201895或Bay11-7082预处理血小板后,其p P65水平降低,IκBα水平升高(P0.01)。结论:STEMI患者血浆及血小板中CCL2表达增高,CCL2/CCR2可能通过NF-κB信号通路影响血小板功能,参与血栓形成。     

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)增强肝癌细胞NF-κB转录活性的实验研究

前期研究结果表明,乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein,HBXIP)具有促进细胞增殖的作用.为了进一步阐明其分子机制,观察了HBXIP对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响.实验中通过基因共转染将NF-κB报告基因质粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表达载体pcDNA3-hbxip导入人肝癌H7402细胞系中,进行荧光素酶活性分析.结果显示:H7402细胞过表达HBXIP后NF-κB的转录活性明显增强;此外,基因转染后经免疫印迹检测显示,与NF-κB二聚体结合的抑制亚基IκBα的磷酸化水平明显增加;同时,提取H7402细胞的核蛋白,然后应用免疫印迹检测细胞核中p65/NF-κB的水平.结果显示,H7402细胞中HBXIP过表达后细胞核中p65/NF-κB的水平明显增加.当应用RNA干扰技术抑制了细胞内源性的HBXIP基因表达后,则出现与上述结果相反的效果.上述结果提示,HBXIP可增加核内p65/NF-κB蛋白水平,进而发挥NF-κB促转录调控的作用.因此,HBXIP可通过调控NF-κB信号途径而促进细胞增殖.     

热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

构建抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型

NF—κB已被证明在肿瘤和炎症过程中起到至关重要的作用。因此,建立抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型至关重要。利用荧光素酶报告基因技术与蛋白印迹技术分别探索TNFα处理浓度及时间对NF-κB报告基因表达和NF—κB抑制亚单位It〈Bα降解的影响,进而构建NF—κB信号通路抑制剂药物筛选模型。实验结果表明,0．01nmol／LTNFα作用24h即能刺激HEK293T细胞中NF—κB报告基因较高水平的表达,且其表达量与TNFα的剂量和处理时间呈正相关性;0．01nmol／LTNFα作用5min即能使Panc-28细胞中IκBα明显降解,20min～30min几乎降解完全,之后IκBα含量又开始增加。NF-κB阳性抑制剂藤黄酸验证表明NF-κB萤光素酶报告基因检测筛选体系和NF—κB抑制亚单位降解筛选体系两种体系稳定可行。结果证明,两种模型可以用于NF—κB信号通路抑制剂药物的筛选。     

细胞水平筛选鉴定激活核因子κB通路的新基因TMEM9B

核因子κB(NF-κB)是细胞内重要的转录因子,其介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中的作用是国内外研究的热点．为了筛选NF-κB通路相关新基因,建立了基于细胞水平的报告基因高通量筛选模型．利用双荧光素酶报告系统检测报告基因荧光素酶活性,通过对构建的439个人类未知功能基因的筛选,获得了一批激活NF-κB信号通路的功能基因,其中基因TMEM9B可以明显激活NF-κB通路．进一步实验显示TMEM9B激活NF-κB通路呈明显剂量依赖性,Western blot及EMSA实验证实,TMEM9B能够促进胞质内NF-κB的抑制分子IκBα的降解,并促使NF-κB由胞质向胞核转移,同时流式细胞术实验发现TMEM9B可引起293T和HeLa细胞的凋亡．总之,所建立的基于细胞水平的NF-κB通路筛选模型稳定高效,筛选并验证TMEM9B可明显激活NF-κB信号转导通路,并从而引起细胞凋亡．     

转化生长因子β激活性激酶在胶质细胞信号转导中的作用机制

丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和 NFκB介导了炎症细胞转录活性的信号转导过程.转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1,TAK1）是这些转导通路的上游激酶.通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的结合蛋白因子（TAK1-binding protein1 TAB1）基因,或与iNOS(可诱导型氧化氮合酶基因)启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒共转染,探讨中枢两类胶质细胞在炎症反应过程中TAK1诱导iNOS 和细胞因子表达的作用机制.结果显示,TAK1明显激活iNOS 和细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）的表达活性. 而且当使用它的下游激酶p38 MAPK、JNK和NFκB的抑制剂（SB203580、SP620125和CAPE）后,这些表达活性明显被抑制.用IκBα的磷酸化突变体质粒(IκBαM)共转染胶质细胞株,能完全抑制iNOS的表达活性.研究结果提示：在胶质细胞内的p38 MAPK、JNK和NFκB信号介导的iNOS和细胞因子的转录表达过程中,TAK1起着非常重要的调节作用.     

池蝶蚌IκBα和c-Rel的结构特征及在LPS刺激下的表达分析

为研究淡水贝类NF-κB/Rel信号通路中核因子κB(Nuclear factor-κappaB, NF-κB)和NF-κB抑制因子(Inhibitors of NF-κB, IκB)的功能,对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)IκBα和c-Rel(以下简称HsIκBα和Hsc-Rel)的序列结构、表达特征及Hs IκBα和Hsc-Rel之间的相互关系进行了分析。结果表明, Hs IκBα的c DNA全长为1783 bp,其开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1083 bp,编码360个氨基酸。Hsc-Rel的cDNA为2414 bp, ORF为2298 bp,编码765个氨基酸。通过构建HsIκBα-ORF-GST和Hsc-Rel-RHD-HIS重组质粒、原核诱导表达和纯化,进行GST-pull down,通过SDS-PAGE和Western Blot检测研究,发现HsIκBα和Hsc-Rel-RHD存在直接的相互作用。通过对池蝶蚌进行脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激后,分别在7个时间点(0、6h、12h、24h、...     

Oncoprotein p28^GANK binds to RelA and retains NF-κB in the cytoplasm through nuclear export

p28^GANK （also known as PSMD 10, p28 and gankyrin） is an ankyrin repeat anti-apoptotic oncoprotein that is commonly overexpressed in hepatocellular carcinomas and increases the degradation of p53 and Rb. NF-IκB （nuclear factor-κB） is known to be sequestered in the cytoplasm by IκB （inhibitor of NF-κB） proteins [1, 2], but much less is known about the cytoplasmic retention of NF-κB by other cellular proteins. Here we show that p28^GANK inhibits NF-κB activity. As a nuclear-cytoplasmic shuttling protein, p28^GANK directly binds to NF-κB/RelA and exports RelA from nucleus through a chromosomal region maintenance-1 （CRM-1） dependent pathway, which results in the cytoplasmic retention of NF- κB/RelA. We demonstrate that all the ankyrin repeats of p28^GANK are required for the interaction with RelA and that the N terminus of p28^GANK, which contains the nuclear export sequence （NES）, is responsible for suppressing NF-κB/RelA nuclear translocation. These results suggest that overexpression of p28^GANK prevents the nuclear localization and inhibits the activity of NF-κB/RelA.     

EWS蛋白质抑制核因子κB的转录活性

目的:研究EWS蛋白质是否参与核因子κB(NF-κB)信号通路,以及EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响。方法:在真核细胞中表达Flag-EWS,利用Western印迹检测其表达;通过双萤光素酶光报告系统,研究EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响及其发挥作用的分子水平。结果:Western印迹检测到相对分子质量为95×103的Flag-EWS能够在真核细胞中正确表达,过表达EWS蛋白质能够抑制TNFα、IL-1β及poly(I:C)激活的NF-κB转录活性;EWS蛋白质能够抑制由过表达HA-TRAF2或HA-p65激活的NF-κB转录活性,其抑制NF-κB转录活性发生在p65转录因子水平。结论:过表达EWS能够抑制多种刺激激活的NF-κB转录活性,这种抑制作用发生在p65转录因子水平。     

JNK3通过与RelA/p65相互作用抑制NF-κB信号通路减弱Bel-7402细胞的黏附能力

JNK信号通路在细胞的炎症、增殖与凋亡等生物学过程中发挥了重要的作用．我们采用酵母双杂交技术发现转录因子p65是JNK3的相互作用蛋白质．体内体外实验均证实JNK3与p65存在蛋白质相互作用．报告基因实验结果表明过表达JNK3抑制TNFα诱导NF-κB介导的转录激活．EMSA结果证明JNK3减弱NF-κB的DNA结合能力．实时定量PCR结果表明JNF3减少NF-κB靶基因的表达．综上所述,我们的研究结果表明JNK3做为一个调节分子在体内发挥了抑制p65转录活性的功能．     

大黄多糖抑制脂多糖引起的TLR-4/ NF-kB通路活化

目的:探讨唐古特大黄多糖(Rheum tanguticum Polysaccharid,RTP)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激上调人结肠癌细胞HT-29中TLR-4/NF-κB通路活性的影响及其机制。方法:将HT-29细胞分为对照组,LPS处理组(1μg/mL,作用30 min,1 h),RTP(1mg/mL,提前LPS 30 min给予)+LPS处理组(1μg/mL,分别作用30 min,1 h),采用免疫荧光法观察NF-κB的细胞分布情况;Western Blot法检测HT-29细胞中IκB-α,磷酸化IκB-α的蛋白变化,以及细胞膜上TLR-4的水平。结果:RTP可抑制LPS刺激引起的HT-29细胞的NF-κB核转位;可有效抑制IκB-α降解及IκB-α的磷酸化;可下调细胞膜上TLR-4的表达。结论:RTP可能通过抑制LPS刺激引起的TLR-4向细胞膜分布,从而抑制了NF-κB信号通路的活化。     

HepG2细胞中TNFα通过NF-κB信号通路下调GSTA1/GSTA4表达

谷胱甘肽巯基转移酶α1/α4(GSTA1/A4)是体内重要的解毒酶,可降低多种内、外源性毒性化合物的毒性．然而,胆汁淤积病人肝细胞内GSTA1/A4的表达是下调的,下调机制尚不清楚．本研究通过肿瘤坏死因子α(TNFα)处理人肝癌细胞HepG2细胞,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测GSTA1/A4、核因子κB(NF-κB)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达．发现TNFα在mRNA水平和蛋白质水平均抑制GSTA1/A4表达,且呈剂量与时间依赖关系．干扰NF-κB信号通路,可减弱TNFα对GSTA1/A4表达的抑制作用．以上结果表明,在HepG2细胞中,TNFα可通过激活NF-κB信号通路抑制GSTA1/A4表达.     

EGCG干预LMP1激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子

为阐明在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子,采用EBV阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1-LMP1细胞,利用噻唑蓝(MTT)法,观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对CNE1和CNE1-LMP1细胞生存率的影响.采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对NF-κB活性的作用.利用间接免疫荧光法,观察EGCG对NF-κB（p65）核移位的影响,再分别提取CNE1和CNE1-LMP1的胞浆及胞核蛋白,通过蛋白质印迹分析EGCG抑制NF-κB（p65）的核移位后胞浆及胞核蛋白中NF-κB（p65）的变化.采用蛋白质印迹分析EGCG对IκBα的磷酸化水平的影响.采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对EGFR启动子活性的影响,并用蛋白质印迹分析EGCG对EGFR自身磷酸化的作用.结果表明EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性,并可抑制NF-κB的活性.EGCG能抑制 NF-κB（p65）的核移位,并抑制IκBα的磷酸化.EGCG对NF-κB信号通路下游的靶基因EGFR的启动子活性及自身磷酸化都有抑制作用.由上述结果可以推断,EGCG对信号转导通路上的NF-κB、NF-κB（p65）、IκBα、EGFR多个靶点分子具有干预作用.LMP1是EB病毒编码的蛋白质,因此,EGCG抑制与病毒相联系的信号转导通路,可能是EGCG抑制与病毒相关的肿瘤的分子机制之一.     

p63在宫颈癌中的研究进展

p63是近年来新发现的p53蛋白家族成员,其在上皮细胞发育,细胞衰老、周期调控与凋亡,癌症的发生、发展中具有重要意义.宫颈癌是影响妇女健康的恶性肿瘤,p63在宫颈癌组织及癌旁组织的差异表达,提示其在宫颈癌中具有非同寻常的作用.介绍了p63蛋白的结构与功能,阐述了在宫颈癌细胞中p63与HPV瘤蛋白E6以及p63与NF-κB信号通路中相关蛋白相互作用关系的研究进展.