丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录－巢式PCR从1份HCV慢性携带者的阳性血清及1份丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定,结果显示克隆到HCV NS2全长基因,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCV NS2区序列以完整读码框架（ORF）为主,一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主,其中三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个于第887位氨基酸的位置出现终止信号,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似,研究表明从我们选择的两种感染者的HCV NS2序列看,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异,这种差异可能与病毒存在于机体的状态一定的一致性。     

中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备北大核心CSCD

从中国丙型肝炎病毒(HCV)3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备。本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率。结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近。C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5%与98.2%),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp。本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具。     

中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备

从中国丙型肝炎病毒(HCV)3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备。本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率。结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近。C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5%与98.2%),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp。本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具。     

乙肝病毒X基因编码氨基酸的变异分析

本文对乙肝病毒感染者中X基因部分区段及其编码的氨基酸变异情况进行了分析。采用巢氏PCR扩增X基因部分区段,对有特异性条带的扩增产物进行序列测定,测序结果用相关软件进行处理,翻译成蛋白质后与文献中已经公布的和疾病相关的变异位点进行比对并进行统计。在90份样本中,扩增出X基因的占42份,与此同时,测序成功的为28份。翻译为氨基酸之后,在X蛋白的C端存在着不同程度的变异,导致X蛋白整个读码框架的改变,主要表现为X蛋白的反式激活能力丢失,这种丢失会造成C末端靶动凋亡与N末端抗凋亡能力的平衡被改变甚至被破坏。     

丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况.利用逆转录-巢式PCR从1份HCV慢性携带者的阳性血清及1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定.结果显示克隆到HCVNS2全长基因,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同.该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架(ORF)为主,一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主,其中三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个于第887位氨基酸的位置出现终止信号,仅一个克隆的序列为完整ORF.对ORF完整的序列进行比较,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似.研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性.     

猪瘟病毒强弱毒株和野毒株E2全基因序列测定及比较分析

为了比较猪瘟病毒 (HCV)野毒株、疫苗株及标准株之间E2基因抗原区域的差异 ,采用RT PCR扩增了HCV石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒 0 3及 0 7株的囊膜糖蛋白E2 (gp55)全基因的cDNA片段 ,分别克隆于pGEM T载体中并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列的推导 ,同时进行了同源性比较及E2结构与功能的分析。所测 4株HCVE2基因的长度均为1 2 73bp,所编码的氨基酸序列均包括部分信号肽序列和完整的跨膜区序列 ,共由 381个氨基酸组成 ;4个毒株E2蛋白N末端的 683位至 690位信号肽序列 (WLLLVTGA)和C末端 1 0 30～1 0 63位跨膜区均为保守序列 ,而且具疏水性 ;N末端抗原功能区中 ,4个E2蛋白与其它所比较序列在位于第 753位至 759位氨基酸处 ,均有一段保守序列RYLASLH ,无一氨基酸发生变异 ,为亲水性 ,在整个E2蛋白抗原谱中抗原性峰值为最高 ,推测对抗原性产生起重要作用 ;4个E2蛋白的氨基酸序列中均含有 1 5个半胱氨酸 (Cys)残基 ,其数量及位置与国外五株HCV(Brescia ,C ,Alfort.ALD和GPE)完全一致。表明…     

甘薯贮藏蛋白(sporam in)A基因编码区克隆及序列同源性分析

采用 PCR技术 ,从我国广泛栽培甘薯品种南薯 88基因组中扩增和克隆到甘薯贮藏蛋白 A基因编码区段 ,并测定了其全部核苷酸序列 .该编码区长 65 7bp,编码一个长 2 1 9个氨基酸残基的蛋白质 ,其中信号肽长 37个氨基酸残基 ,成熟蛋白质长 1 82个氨基酸残基 ,其分子量为 2 0 k D.将该片段的核苷酸序列与已登录在 Gen Bank中的另外 6个甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列进行比较 ,发现其同源性高达 90 % ,说明甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列具有高度保守性 .虽然 7个基因编码区的核苷酸总变异为 1 0 % ,但在每两个基因之间的比较则表明其核苷酸的变异范围小于 7% .     

丙型肝炎病毒基因变异及候选保守表位分析

HCV分离株主要分为4个基因型(HCV Ⅰ～Ⅳ),各型间的氨基酸及核苷酸组成同源性均小于80％, 氨基酸变异率分别为C 8%,E1 35%,E2/NS1 53%,NS3 27%,NS4 35%,NS5 39%.不同型别的HCV有不同的地区分布特征.根据HCV表达产物多肽的保守性、亲水性、抗原性及空间构型等特性,已在HCV表达产物中鉴定出一些高度保守的候选B细胞表位及T细胞表位, 其中B细胞表位一般为12～40肽, T细胞表位一般为7～9肽, 这些B/T细胞保守表位的鉴定, 将有助于推动HCV的免疫治疗及疫苗研究的发展.     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制乙型肝炎病毒转录的分子机理

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白抑制乙型肝炎病毒 (HBV)表达的分子机理 ,从HCV和HBV共感染中国病人血清中分离了 5个含HCV 5′非编码区 ( 5′NCR)和核心区 (CR)cDNA序列的克隆 .序列比较和系统发育分析显示 :从共感染病例中分离的HCV序列与其它已发表的从单独HCV感染病例中分离的序列没有显著差异 .共转染实验证实采用从其中 1例共感染病人中分离的核心蛋白cDNA基因所表达的核心蛋白 ,可抑制HBV表面抗原 (HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的表达 ,缺失突变分析说明HCV核心蛋白的C端疏水区对这种抑制作用是必需的 ,报道基因产物分析进一步说明了HBVC启动子和增强子Ⅱ是HCV核心蛋白的效应靶序列之一 ,而HCV核心蛋白在肝细胞和非肝细胞中均对HBV和其他细胞和病毒的基因的转录起负调节作用 .因此 ,认为HCV核心蛋白是一种多功能的负调节因子 ,与HCV和HBV以及HCV与细胞之间的相互作用密切相关     

小西葫芦黄化花叶病毒分离物的3′末端序列多态性研究

研究了来自中国大陆9个小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）分离物的基因组3′末端核苷酸序列及所推导的外壳蛋白（CP）氨基酸序列以及3′末端非编码区（UTR）序列,并与其它地区所报道的16个ZMYV分离物进行了同源性比较。ZYMV CP基因核苷酸序列具有一定的寄主相关性和地域相关性,但总体上其关联程度不明显;同时,CP氨基酸序列的寄主适应性程度明显高于地域相关性。25个ZYMV分离物的CP氨基酸序列根据其变异程度分为2个区： N端约41个氨基酸为高度变异区,CP核心区和C端氨基酸序列为保守区。研究结果初步揭示了ZYMV作为单链RNA病毒通过与寄主相互作用而表现寄主适应性变异的趋势。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物（EMMPRIN）基因转录的影响。方法：构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果：HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为＋1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论：HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。     

多刺蚁属细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ序列变异及其进化关系

从Gen Bank下载多刺蚁属26个不同种的细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COXⅡ)蛋白部分氨基酸序列进行分析,研究多刺蚁细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的氨基酸序列变异和系统进化关系。多刺蚁属种间存在氨基酸变异位点84个,占总氨基酸数目的 36%,而N端跨膜螺旋区氨基酸保守性最高。采用MEGA 4.0构建的邻接法(NJ)系统发育树表明:佛瑞尔刺蚁(Polyrhachis foreli)和甲胄刺蚁(Polyrhachis andromache)聚为一枝,双钩刺蚁(Polyrhachis bihamata)和叉形刺蚁(Polyrhachis ypsilon)聚为一枝,麦凯刺蚁(Polyrhachis mackayi)、澳洲刺蚁(Polyrhachis australis)和软毛刺蚁(Polyrhachis pilosa)三个种聚为一枝,这些种间亲缘关系较近;基于COXⅡ蛋白序列的系统发育关系分析与基于细胞色素b蛋白的系统发育关系既存在一致性,也存在一定的差异。多刺蚁属中序列变异度最大的4个种的COXⅡ对应的3D结构在螺旋和折叠排列方式上完全相同,表明多刺蚁属内COXⅡ序列变异并不影响其结构的形成。     

苏南地区1b型丙型肝炎病毒包膜区变异进化研究

本研究旨在了解本地区丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)基因型构成的前提下,分析1b型丙型肝炎病毒包膜2(second envelope glycoprotein E2)区的变异和种系进化,并研究其准种变异与临床肝病活动度的关系。对宜兴市人民医院收集的抗HCV抗体阳性患者166名,RT-PCR方法检测HCVRNA,HCVRNA阳性患者采用型特异性引物分型法确定病毒基因型;选择其中未经干扰素治疗的43例1b型慢性丙型肝炎患者的血清标本,扩增E2区,从中选取肝硬化患者4例,慢性非肝硬化患者6例的E2区PCR产物纯化测序,序列采用CLUSTALW与GENBANK上多株不同型别的HCV序列进行比对分析,结果采用Phylip软件构建遗传进化树;并观察E2区高变区1(HVR-1)的氨基酸(aminoacid,aa)残基序列的变异特征;采用单链构象多态性垂直电泳检测43例患者个体内HCVE2区准种的变异情况,比较不同肝病活动度患者准种变异情况。结果表明本地区HCV以1b型为主(84.3%),对E2区基因序列和氨基酸序列变异的分析显示其变异具有一定的规律性,种系进化树提示本地区HCV病毒序列与上海、湖南、日本等地的HCV株有较近的亲缘性。43例患者中ALT高于正常的丙型肝炎患者准种复杂程度明显高于ALT正常者(P<0.05)。故本地区HCV基因变异符合中国东南部的特点,基因变异与临床肝病活动度具有相关性。     

HCV抗原表位预测

应用网络生物信息资源查找丙型肝炎病毒基因组全序列,用软件Lasergene中的EditSeq将来自中国河北株mRNA序列翻译为氨基酸序列,尔后用程序Protean进行氨基酸序列分析,对HCV各区段的B细胞抗原指数进行预测。同时又在两个网站对中国汉族人中频率较高的HLA基因型进行CD8和CD4T细胞表位预测。B细胞和T细胞抗原表位预测结果对于HCV诊断试剂和疫苗研制有重要的指导意义。     

外源高表达PC-1蛋白N端43个氨基酸可加速人前列腺癌细胞系C4-2的生长

研究PC-1蛋白N端43个氨基酸表达对人前列腺癌细胞C4—2生长的影响。用DNA重组技术将含PC—1蛋白N端43个氨基酸的DNA序列正向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,采用脂质体法将重组质粒稳定转染进C4—2细胞中,RT—PCR分析外源序列的转录情况,固相ELISA法测定PC—1蛋白N端43个氨基酸的表达,MTT实验分析细胞的生长速度。结果获得了稳定转染PC—J基因N端43个氨基酸的前列腺癌细胞株,在该细胞株中外源PC—1蛋白N端43个氨基酸得到高表达,细胞生长速度较对照细胞加快了38％。结果表明外源PC—I基因N端43个氨基酸高表达可提高人前列腺癌细胞C4—2的生长速度,推论PC—J基因高表达可能在人前列腺癌的发展中起一定的促进作用。     

牦牛Eppin基因CDS的克隆及其在附睾不同区段中的表达研究

为了研究牦牛附睾组织中精子成熟的相关机理,并为探讨高原动物的生殖机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛附睾Eppin基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,Eppin基因和编码序列特征进行了预测和分析。结果表明,牦牛Eppin基因的CDS含有一个405 bp长度的片段,由134个氨基酸编码;牦牛Eppin基因对应的蛋白分子量和理论等电点分别为15.09 ku和8.67 ku,其对应的氨基酸没有跨膜结构,归于近水性蛋白;25个α-螺旋、27个延伸链、2个β-折叠及80个无规则卷曲构成其蛋白质二级结构;牦牛Eppin基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究应用实时荧光定量PCR技术分析Eppin基因在附睾组织3个不同区段(头部,颈部和尾部)中的表达情况,荧光定量PCR结果显示,Eppin基因在牦牛附睾组织3个不同区段中均有不同程度的表达,在附睾头部中表达最高,颈部和尾部表达较低。本研究将为牦牛附睾精子成熟的机制和Eppin基因在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供一定的基础数据。     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

丹参中硫堇基因SmTHI的克隆和表达分析

丹参EST序列的Blast分析表明,一条序列与硫堇（thionin,THI）基因有较高的同源性,该序列长575bp,包含1个长366bp的开放阅读框（ORF）,编码121个氨基酸,命名为SmTHI,GenBank登陆号为DQ212984。在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平上克隆到该基因的全编码区序列的结果表明,该基因无内含子。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物的THI蛋白前体高度同源,并符合植物硫堇类蛋白的序列模式和特征：C—C—x（5）．R．x（2）-[FY]-x（2）-C,N端具17个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的58个氨基酸为酸性多肽部分。成熟的THI蛋白带正电荷,偏碱性,推测可能有抗病原微生物活性。实时定量PCR检测SmTHI在丹参不同组织部位的表达以及在黄瓜细菌性角斑病菌（PSL）、NaCl和水杨酸（sA）溶液诱导下的表达结果表明：SmTHI在植物的根、茎和叶中均有不同程度的表达,其表达丰度为叶〉茎〉根：在PSL、NaCl和sA溶液诱导下该基因的表达呈上调趋势。     

瓜实蝇嗅觉受体基因的克隆及表达谱分析

昆虫的嗅觉受体是一个高度变异的蛋白家族, 其中一类Or83b嗅觉受体在不同昆虫体内高度保守, 在昆虫的行为调控过程中起到十分重要的作用。为进一步探讨Or83b受体的功能, 本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett) Or83b-like受体的全长cDNA序列, 命名为BcucOr83b-like（GenBank登录号： HM745934）。测序结果表明, BcucOr83b-like开放阅读框全长1 422 bp,编码473个氨基酸残基。氨基酸序列比对表明, 此序列具有Or83b受体的典型特征, 序列中具有7个跨膜区和高度保守的C端区域。BcucOr83b-like与其他昆虫的Or83b具有较高的氨基酸序列一致性, 其中与桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）Or83b的序列一致性高达99.6%。对该基因在瓜实蝇成虫不同组织和发育时期表达量的荧光定量PCR分析表明, BcucOr83b-like主要在瓜实蝇成虫触角中表达, 头部（去除触角）、 雌虫前足和翅中也有较高的表达; 瓜实蝇在各个发育时期的表达水平不同, 在刚羽化雌成虫中的表达量最高。本研究为深入研究瓜实蝇Or83b受体的功能提供了理论依据。     

中国野蚕一种强抗病毒蛋白的基因分析和活性鉴定

以最近报道的家蚕抗病毒蛋白基因为线索,从中国野蚕（Bombyx mandarina Moore）中肠内克隆了抗家蚕BmNPV病毒的SP-2 cDNA（GenBank登录号：AY945210）,基因大小855bp,编码284个氨基酸的蛋白质,分子量29．6kD,基因组全长1376bp,包含5个外显子和4个内含子．该基因的表达仅限于中肠,具有组织特异性,在幼虫龄中表达水平较高,而在眠期和熟蚕没有表达．推导其氨基酸序列,发现其C端氨基酸序列与已报道的家蚕相应序列差别较大,有8个氨基酸完全不同．通过体外重组技术,由高效基因表达系统获得大量重组蛋白,发现该蛋白具有很强的抗家蚕BmNPV活性,与家蚕对应的抗病毒蛋白BmSP-2相比,其抗BmNPV活性高1．6倍．初步认为,该蛋白质C端序列差异可能是造成家蚕与野蚕抗病毒活性差别的主要原因．