嗜热链霉菌质粒的研究

从分属于12个种的28株嗜热链霉菌中检测到热灰紫链霉菌(S.thermogriseoviolaceus)T272带有3个质粒(pST1,pST2,pST3),热藤黄链霉菌(S.thermoluteus)T422带有1个质粒(pST4),经电镜观察得到证实,并按经验公式求得其分子量分别为27、8.3、6.9、25.7kb。实验数据表明,T272与利福平抗性有关的基因可能位于质粒pST1;而pST4可能与rRNA甲基化酶合成有关,推测该酶使T422具有红霉素、螺旋霉素、林可霉素抗性。未发现这些质粒与宿主的高温生长特性有关。     

一株产生葡萄糖异构酶的嗜热放线菌的研究

本文对产生胞外葡萄糖异构酶的一株嗜热放线菌进行研究。根据它形态和生理特征,可以初步鉴定为不吸水键霉菌嗜热亚种(Streptomycetes ahygroscopicus subsp.thermophilus Yan,Zhang et al.)并对通过紫外线诱变得到的变异株M1033所产生葡萄糖异构酶的某些性质进行了初步探讨。该菌的胞外酶占80%左右,发酵条件粗放,发酵温度为41±1℃,酶的热稳定性温度是70℃。最适pH和温度分别为7.7—8.8和70～80℃。Zn~(2 )、Mn~(2 )、Cu~(2 )、Fe~(2 )和Ba~(2 )等金属离子对它的酶活力虽有抑制作用,但Co~(2 )和Mg~(2 )二种金属离子却有明显的激活作用。     

嗜热链霉菌的一个新种和一个新亚种

在研究太原地区棉籽壳的微生物区系中,从棉籽壳发酵料中经50℃培养分离到5株嗜热链霉菌,经鉴定为嗜热链霉菌的一个新种和一个新亚种:热深蓝紫链霉菌(Streptomycesthermoatrocyaneoviolaceus)、热深蓝紫链霉菌太原亚种(Streptomyces thermoatrocyaneoviola-ceus subsp.taiyuanensis).     

嗜热链霉菌过氧化氢酶的纯化及性质研究

嗜热链霉菌(Thermostreptostreptomyces sp.)T485的除去菌体的培养液,经硫酸铵盐析,Sepha- dex G—100、DEAE—Sephadex A-50及羟基磷灰石等柱层析,得到了凝胶电泳均-的过氧化氧酶,纯化了954倍,得率为7％。用浓度梯度PAGE测定分子量为152000,SDS—PAGE测定亚基分子量为57000,凝胶薄层等电点聚焦测定等电点为4．25。过氧化氢酶的反应最适温度为60℃,最适pH为7．0;对H2O2的K为50 mmol·L-1,Vmas值为6．0 mmol·min-1·mg-1。Nall3和Hg2+对酶活力有强烈抑制作用．Ca2+对酶活力有激活作用。测定了波长200—500nm的吸收光谱,在405nm处有明显的吸收峰。根据受NaN3,抑制和吸收光谱性质,推测它为含血红素酶。此外还测定了过氧化氢酶的氨基酸组成。     

耐热过氧化氢酶产生菌的筛选和发酵条件的研究

从59株嗜热放线菌中筛选出一株产胞外过氧化氢酶活力较高的嗜热链霉菌(Thermo-sueptomyces sp．)T485。其产酶的适宜条件为培养温度50℃,培养基pH6—8,碳源麦芽糖,氮源酵母膏,250ml三角瓶装30—50ml培养基,振荡培养48h,产酶可达140u／ml。     

吸水类群链霉菌的研究IV．两个新种的鉴定

从湖北省房县郊区土壤中分离到SH-121和SH-4两株菌。对其形态、培养特征、生理生化特性、细胞壁化学组份及DNA中G+C克分子含量进行了研究。此两株菌在高氏合成一号等培养基上均产生带成链孢子的气生菌丝体,并具有吸水现象,细胞壁化学组份I型,属于链霉菌属吸水类群,经与已知种比较,定为两个新种,命名为肉色吸水链霉菌(Streptomyces car-neohygroscopicus Zhou et Lin,nov．sp．)和团块普拉特链霉菌(Streptomtces glomeroplatensis Zhou et Lin,nov．sp．)。     

嗜热放线菌类群分类的研究I.嗜热链霉菌的分类鉴定

从我国北京和昆明地区采取土壤、厩肥、畜粪、堆肥和温泉土样品,经52℃培养分离的链毒菌菌株,通过分类研究,证明其中有3个新种和2个新变种：热吸水链霉菌(S．Thermohygros-copicus)、热吸水链霉菌锈赤变种(S．Thermohygroscopicus var. rubiginosus)、热灰紫链霉菌(S. therrnogriseoviolaceus)、热橄榄链霉菌(S.thermoolivaceus)、热橄榄链毒菌褐色变种(S.ther-moolivaceus var. fuscus)。     

应用分散和差速离心法分离嗜酸和耐酸链霉菌的试验及评价*

新的微生物资源的开发离不开菌种分离技术的改进和分离效率的提高。我们采用一种新的分离方法——分散和差速离心法(Dispersion and Differential Centrifugation,DDC),以传统的振荡法做对照,对12份酸性土壤样品进行了链霉菌的分离。结果表明DDC方法的分离效率是传统方法的2—20倍,且选择性好。用DDC方法共分离出链霉菌249株,归属于12个颜色类群,其中的45株代表菌株的形态和细胞壁类型均符合链霉菌的特征,最适生长pH均为4．5—5．5。结果表明应用DDC方法分离非常见的嗜酸和耐酸链霉菌是可行的。     

不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的克隆与序列分析

克隆不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因.以不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA作为模板,根据已知的胆固醇氧化酶基因的保守序列设计简并引物进行PCR扩增,PCR产物与载体连接、转化,构建重组质粒.获得了不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因重组质粒,序列测定并分析.     

不吸水链霉菌葡萄糖异构酶的物化表征

葡萄糖异构酶是一种催化葡萄糖异构为果糖的酶。本文用紫外吸收光谱、红外光谱、氨基酸组分分析、聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、超薄 层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳技术研究了不吸水链霉菌嗜热亚种M1033菌株产生的葡萄糖异构酶的一些物化性质。结果表明由本实验室制备的均一葡萄糖异构酶的A₂₈₀与A₂₆₀的比值是1.76。它是由一个亚单位组成的酶分子。最小分子量是49000。pI值是5.2。氨基酸组分与其它来源的葡萄糖异构酶的氨基酸组分相比较有一些差异,其中Glu,Gly,ALa和Leu的含量都此其它异构酶的高,而Met,Trp,Asp,Thr则比其它葡萄糖异构酶的低。     

转座子Tn5096对刺孢吸水链霉菌北京变种PR220转座的诱变

用大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒ｐＣＺＡ１６８多次转化农抗１２０产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种ＲＦ２２０的原生质体,均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种１０－２２突变株的链霉菌质粒ｐＩＪ７０２可以转化ＲＦ２２０,但转化频率只有数十个转化子／μｇＤＮＡ。用来自ＲＦ２２０本身的ｐＩＪ７０２对消除ｐＩＪ７０２后的ＲＦ２２０的原生质体进行了再转化,转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理ＲＦ２２０的菌     

吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶分离纯化方法改进及结构研究

利用改进的新方法,对吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶(TGase)进行分离纯化.将发酵上清液经过硫酸铵分级盐析后,用Hitrap Q HP阴离子交换柱除掉干扰较大的色素,之后又经Superdex 75 10/300GL凝胶柱和Hitrap Q HP阴离子交换柱的分离,得到高纯度的TGase.纯化后TGase的比活力可达24.5 U/mg,回收率为39.9%.TGase的N-末端前6个氨基酸经测序为DAADER.该研究是对吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列的首次报道.将吸水链霉菌TGase的N-末端氨基酸序列与已报道的其它3种链霉菌来源的TGase的N-端氧基酸序列进行比对,序列相似性不高.预测和分析了吸水链霉菌TGase的高级结构,为进一步研究TGase结构和功能的关系,蛋白分子定向改造提供理论依据.     

云南酸性土壤中度嗜酸链霉菌的多样性

[目的]了解酸性土壤环境里中度嗜酸链霉菌的多样性,调查其物种资源.[方法]用分散和差速离心法及选择性分离培养基从14份云南酸性土壤样品中分离到367株具有链霉菌培养特征的放线菌,并进行了颜色分群.从各颜色类群中选取代表菌株共97株,通过显微形态观察和pH梯度生长实验确定其中的中度嗜酸链霉菌.进一步从中筛选出16株中度嗜酸链霉菌代表菌株,进行16SrRNA基因序列的相似性和系统发育分析,并结合基因组DNA-DNA相关性数据.[结果]分离菌株归为12同的颜色类群,其中80%属于中度嗜酸链霉菌,其代表菌株在系统发育树上形成了8个距离较远且与已知种不同的进化分枝,可能代表链霉菌属内至少8个不同的新基因种.[结论]用以上方法筛选出的中度嗜酸链霉菌可归为8个不同于已知种的进化群,说明云南酸性土壤含有丰富多样的中度嗜酸链霉菌新物种.     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

嗜热放线菌多肽电泳图谱的研究

嗜热放线菌是引起农民肺的主要病因,但其致病菌株可有多种。我们应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技术对引起农民肺的三株嗜热放线菌的电泳图谱进行了对比分析,发现这三种嗜热放线菌多肽的电泳图谱各不相同,都具有特征性的主要带型。实验结果表明ＳＤＳ－ＰＡＣＥ技术有助于快速鉴定嗜热放线菌菌种。     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素-阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术,将来自变铅青链霉菌TK24菌株的pU702质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件,其原生质体形成率达到10^8／mL,再生率约为0．2％,转化率为10^2-10^3个转化子／μg质粒DNA。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组经Sau3AI不完全酶切,回收3~9 kb DNA酶切片段,用T4连接酶将回收片段按一定比例与经BamHI酶切、南极热敏磷酸酶去磷酸化处理后的pUC18质粒载体连接,热激法转化受体菌E.coliDH5α,在含有IPTG/X-gal和Amp 的LB平板上筛选重组子,所得克隆数为9×103个,以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7 Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99%的基因组,达到了建库要求的理论值。随机挑取白色菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建,为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

一种高效可直接用于PCR扩增的不吸水链霉菌基因组DNA的提取方法

通过对提取不吸水链霉茵基因组DNA的冻融法、微波法和溶茵酶破壁法等几种方法进行对比、分析,得出结论:溶茵酶破壁法所提取的不吸水链霉茵基因组DNA可直接用于PCR扩增.这为今后不吸水链霉菌相关基因的实验研究提供了可靠的理论依据.     

吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因的阻断及其对细胞分化的影响

【目的】通过对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中谷氨酰胺转胺酶基因的阻断,以期深入了解谷氨酰胺转胺酶生理功能,并为谷氨酰胺转胺酶发酵优化提供新的研究思路。【方法】以温敏型质粒pKC1139为出发质粒,构建阻断吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶编码基因的重组质粒pKC1139-TG1,转化吸水链霉菌原生质体,通过抗性筛选和PCR验证,成功得到一株谷氨酰胺转胺酶阻断菌株,命名为S.h-△TG。【结果】以原始菌株为对照,重组子基内菌丝生长不受影响,但是由基内菌丝分化形成气生菌丝的过程受到影响,重组子基本不产气生菌丝。【结论】谷氨酰胺转胺酶对吸水链霉菌气生菌丝的形成有着重要的影响,参与链霉菌气生菌丝的形成。     

嗜热微生物酶的嗜热机制及应用研究进展

从细胞膜组分、蛋白质结构、遗传物质、钨元素等方面阐述了嗜热微生物酶的嗜热机制 ,并简要介绍了其应用的研究进展。