中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析

参照天然抗菌肽CM4(ABP-CM4)氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,采用rPCR法获得CM4基因后重组到表达载体pET32a上,在E.coli中融合表达。表达产物以可溶性存在,经Ni2 -NTA琼脂糖亲和层析获得融合蛋白,再经甲酸切割、亲和层析和阳离子交换层析,得到纯化的重组抗菌肽。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

抗菌肽CM4基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

为了在毕赤酵母中获得抗菌肽CM4表达,将抗菌肽CM4基因克隆入表达质粒pPIC9,SacⅠ线性化的重组表达质粒pPIC9-CM4电击转化P.pastorisGS115(his-),采用MM、MD板和PCR法筛选Mut 表型,甲醇诱导表达;抗菌活性检测、Tricine-SDS-PAGE及酸性活性电泳均表明抗菌肽CM4在毕赤酵母中成功地分泌表达;重组抗菌肽CM4对黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)都有很强的抑菌活性。     

人可溶性白介素4受体(sIL4R)在大肠杆菌中的表达和纯化

白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂 ,应用于哮喘等疾病治疗 .采用RT PCR方法 ,以人单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序确证后插入大肠杆菌高效表达质粒pBV2 2 0 ,得到重组质粒pBV2 2 0 sIL 4R ,重组质粒转化E .coliDH5α .重组菌经温度诱导后超声破碎得到包涵体 ,经SuperdexHR75分子筛柱和DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱进行纯化 ,HPLC检测表明纯度达到 90 % .N端测序证明 ,重组sIL 4R与天然sIL 4RN端序列完全一致 .Western印迹、配基结合印迹对重组sIL 4R进行鉴定 .结果表明 ,重组sIL 4R具有结合IL 4的生物学活性     

抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）与抗菌肽CM4融合基因的真核表达载体。方法：采用递归PCR（rPCR）将GFP基因与CM4基因通过一段核苷酸片段连接成GFP-CM4融合基因,构建真核表达载体pcDNA3-GFP-CM4,用脂质体介导转染人K562白血病细胞,用MTT检测其活性。结果：融合基因可在K562细胞中表达,抗菌肽CM4的表达可抑制K562细胞的生长。结论：为全面了解抗菌肽的生物学活性及其在基因治疗中的可能作用提供了重要的理论依据。     

家蚕抗菌肽CM4对大肠杆菌超微结构影响的研究*(简报)

The effect of antibacterial peptide CM4 of Bombyx mori against E. coll K12 was investigated using scanning electron microscopy(SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The ultrastructural changes of E. coli K12 were observed by the challenge of the purified antibacterial peptide CM4. The results showed that the antibacterial peptide caused a series of pathological changes on E. coli. SEM and TEM revealed aggregates of bacteria and SEM revealed wrin-kled bacterial surfaces in the early stage. Thereafter, plasmolysis was observed with irregular holes appearing in the two ends of bacteria and the cytoplasmic contents of the cells leaking out. Finally, bacteria became empty vesicles and disintegrated into small fragments subsequently. Comparatively, the bacterial membrane was normal and the bacterial structure remained intact in the control group.     

抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

抗菌肽作为新一代抗生素的潜在应用价值使其备受关注,大量高纯度的抗菌肽是开展基础及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资源有限、纯化困难,化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定,因此通过基因重组表达得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法。目前采用大肠杆菌表达系统获得抗菌肽已成为研究者的首选,通常以形成融合蛋白的方式表达,这不仅可避免抗菌肽对宿主的杀伤作用,也保护了抗菌肽免受蛋白酶降解。文章结合课题组的研究工作,综述了近年来抗菌肽在大肠杆菌中表达的融合载体、融合蛋白的裂解方法及表达条件优化的研究进展。     

合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化

以pBV220为载体,进行了合成可溶型人干细胞因子(SCF)cDNA在大肠杆菌中的温控型的高效表达。SDS-PAGE检测表明,在实验室摇瓶培养中,目的蛋白可占菌体可溶蛋白的40％左右。表达产物复性后,经过凝胶过滤、离子交换层析,得到了电泳纯的重组rhSCF,经测定,纯化的rhSCF相对分子质量为19000,氨基端15个氨基酸的序列与天然可溶形式的hSCF成熟分子的序列完全一致。     

抗菌肽CPIOA在大肠杆菌中的融合表达

CPIOA是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造,且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。研究根据已报道的CP10A氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计CP10A的核苷酸序列,利用PCR技术合成相应的DNA序列,后克隆构建重组表达载体pET32a（＋）-CP10A,转入大肠杆菌AIM94菌株。经IPTC诱导表达和15％SDS—PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在,且融合表达量占总蛋白的50％。在变性条件下经Ni—NTA亲合柱层析及复性,最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。研究首次实现了CPl0A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达,为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

Purification of a novel antibacterial short peptide in earthworm Eisenia foetida

Earthworms live in an environment with abundantpathogens. These pathogens are, firstly, bacteria living inwater or soil that are ingested during feeding or introducedinto the body following injury. Parasites, particularlylarval forms, which represent the dissemination phase,are another important group of potentially pathogenicagents. During the course of evolution, earthworms havedeveloped defense strategies against these living patho-gens [1,2]. Earthworms lack true antibodies and hence anada…     

抗菌肽CM4对串珠镰孢菌孢子的抑制杀伤效应

家蚕抗菌肽CM4可抑制串珠镰孢菌孢子的生长发育.扫描电镜超微结构观察显示孢子空泡化,内部结构萎缩成团,对照组的孢子结构则完好无损,发育正常.家蚕抗菌肽与真菌作用,用激光共聚焦扫描图象分析,发现荧光素FITC标记抗菌肽先是聚集包围细胞,呈中间浓度大,两头浓度小状态分布,进而两头断裂,或形成空泡,最后连空泡的膜也破裂,细胞死亡,形成一堆碎片.     

光滑鳖甲抗菌肽的原核表达条件优化及其抗菌活性

【目的】本研究旨在探索光滑鳖甲Anatolica polita borealis抗菌肽Ap AMP1015的最佳原核表达条件及其抗菌活性。【方法】利用生物信息学方法对得到的Ap AMP1015基因序列和蛋白结构进行分析,运用原核表达技术表达Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,通过Western blot方法鉴定蛋白,并利用亲和层析的方法获得纯化的Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,抑菌圈实验验证蛋白抗菌活性。【结果】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,其开放阅读框长387 bp,编码128个氨基酸,其中包含由19个氨基酸组成的信号肽和75个氨基酸组成的成熟肽。NCBI数据库同源序列比对结果显示该蛋白属Coleoptericin抗菌肽家族。确定了蛋白表达的最佳条件:0.1 mmol/L IPTG 150 r/min 25℃诱导4 h。肠激酶切割后的Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌Escherichia coli的生长。【结论】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,获得了其编码蛋白的最优表达条件,研究发现Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌的生长。本研究为光滑鳖甲抗菌肽Ap AMP1015的应用和进一步研究奠定了基础。     

黄粉虫抗茵肽TmAMP3在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

昆虫抗菌肽具有广谱抗菌活性,克隆黄粉虫Tenebrio molitor抗菌肽基因,进行原核表达和活性检测,为昆虫抗菌肽推广应用奠定一定基础.根据GenBank公布的黄粉虫抗菌肽序列设计特异引物,以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因TmAMP3,将其亚克隆至pET-30a表达载体中,转化到大肠杆菌Escheric...     

斜纹夜蛾Cecropin D成熟肽的原核表达及活性检测

采用RT-PCR方法从斜纹夜蛾Spodoptera litura脂肪体组织中扩增得到了Cecropin D成熟肽基因序列,分析发现Cecropin D成熟肽与斜纹夜蛾Cecropin B之间存在2个氨基酸残基的差异。将获得的基因序列连接入原核表达载体pGEX-4T-1,并在原核细胞中实现了该蛋白的融合表达。SDS-PAGE结果表明,诱导后的宿主菌比未诱导菌中多出了一条融合蛋白表达带,诱导后1 h就可以检测到该蛋白,从诱导后1 h到5 h该蛋白在表达量上没有明显的差异。生长曲线显示在IPTG诱导后宿主菌的生长受到明显的抑制,纯化后的蛋白对细菌具有一定的抑制作用。     

TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli

Antimicrobial peptide CM4, a small cationic linear α-helical peptide that consists of 35 amino acids, was isolated from Bombyx mori. To improve the expression level of CM4 in Escherichia coli, tandem repeats of CM4 gene were constructed and expressed as fusion proteins (TrxA-nCM4, n = 1, 2, 3,…,8) by constructing the vectors of pET32-nCM4 (n = 1, 2, 3,…,8). Comparison among the expression levels of soluble fusion protein TrxA-nCM4 (n = 1, 2, 3,…,8) suggested that BL21 (DE3)/pET32-3CM4 was an ideal recombinant strain for CM4 production. Under the selected conditions of cultivation and isopropylthiogalactoside (IPTG) induction, the expression level of CM4 was as high as 68 mg/l with about 21% of fusion protein in soluble form, which was the highest yield of CM4 reported so far.     

Expression and purification the antimicrobial peptide CM4 in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis>

The antimicrobial peptide CM4 is a 35-residue cationic peptide. To explore a new approach for the expression and purification of CM4 in Escherichia coli, the CM4 gene was cloned into the vector pET32a to construct an expression vector pET32a-CM4. The fusion protein Trx-CM4, purified by Ni²⁺-chelating chromatography, was cleaved by hydroxylamine hydrochloride to release recombinant CM4. Purification of recombinant CM4 was achieved by reverse HPLC chromatography, and about 1.4 mg/l active recombinant CM4 with the purity more than 98% was obtained. The recombinant CM4 showed antimicrobial activities that were similar to synthetic one. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users. An erratum to this article can be found at     

家蚕拟抗微生物肽Gloverins基因（Bmglv）的原核表达及抗菌活性鉴定

家蚕Bombyx mori基因组全测序于2004年完成后,由家蚕基因组注释发现了35条拟抗微生物肽基因序列。本研究选取其中的5条Gloverins同系物（isoforms）基因(BmglvB,BmglvA2 ,BmglvA3,BmglvA5和BmglvA6 ),克隆至pET-21d载体,转化Escherichia coli Rosetta^TM（DE3）宿主菌进行表达;克隆表达的5个家蚕Gloverins同系物基因大部分以可溶形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化和Sephadex G-10脱盐处理后,采用平板孔穴抑菌法测定其抗菌活性。结果表明：注释发现的5条家蚕拟抗微生物肽Gloverins同系物基因,具有与在其他昆虫中已鉴定报道的Gloverin相似的抗革兰氏阴性细菌的功能,实验确认了它们就是家蚕Gloverins抗微生物肽基因。     

hsBAFF对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖与免疫应答及胞内Ca2+水平的影响

目的：探讨大肠杆菌表达的人源可溶性B淋巴细胞激活因子hsBAFF对小鼠脾脏B淋巴细胞免疫反应及其对胞内游离Ca^2＋信号变化的影响。方法：选择20只健康ICR小鼠,雌雄各半,随机分成两组（n=10）：①对照组;②hsBAFF实验组。实验组小鼠腹腔注射含hsBAFF（0．1mg／kgbw）的PBS溶液,对照组注射同等剂量的PBS溶液．连续8d。用MTT法检测小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖及其对LPS刺激的免疫反应,并用激光共聚焦显微镜分析脾脏B淋巴细胞胞内钙离子水平（[Ca^2＋]i）变化。结果：hsBAFF注射小鼠的脾脏B淋巴细胞增殖和对LPS刺激的免疫反应均明显高于对照组（P〈0．05）;hsBAFF注射组[Ca^2＋]i荧光强度维持在相对稳定的高水平上波动,平均荧光强度显著高于对照组（P〈0．01）,且荧光强度变化率小于对照组。结论：大肠杆菌表达的hsBAFF能促进B淋巴细胞的增殖和免疫应答,从而增强机体免疫功能。hsBAFF激活小鼠脾脏B淋巴细胞可能与[Ca^2＋]i升高有关。