利用同源重组提高外源GUS基因在植物组织中表达

将１８Ｓ ｒＲＮＡ基因的部分片段,或烟草的核骨架结合序列（ＳＡＲｓ）作为同源序列与外源ＧＵＳ基因作为报告基因构建成用于基因打靶载体,以枪或农杆菌介导转化到拟南芥的根组织中,检测ＧＵＳ基因瞬间表达的结果显示,两种同源基因序列均可提外源ＧＵＳ基因的表达。     

烟草黄矮双生病毒中双向启动子的活性及其调节控制

将烟草黄矮双生病毒（ＴｏｂＹＤＶ）中双向启动子的区域,以不同长度的片段和方向插入启动子分析载体ｐＧ１,与ＧＵＳ报道基因和ＮＯＳ终止子融合。同时,将各个ＴｏｂＹＤＶ读码框区域插入表达载体ｐＡＲＴ７中,置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和ＯＣＳ终止子之间。用电穿孔法将各种启动子构建物个别地或者与读码框构建物成对地导入烟草和玉米原生质体,以考察ＴｏｂＹＤＶ启动子控制下ＧＵＳ基因瞬间表达的活性,以及ＴｏｂＹＤＶ的读     

小麦中外源基因瞬间表达调控研究及兔防御素（NP—1）基因的转化

将不同５上游调控序列驱动下的ＧＵＳ基因用基因枪法导入小麦幼胚和胚性愈伤组织,通过组织化学分析法和荧光分析法对ＧＵＳ基因的表达进行定量检测,比较了几种烟草花叶病毒（ＴＭＶ）Ω增强子序列对小麦中外源基因瞬间表达的调控作用;然后将其中效率最高的玉米Ｕｂｉｌ启动子与兔防御素（ＮＰ－１）连接起来,并加上Ｎｏｓ终止子,构民ＮＰ－１基因小麦表达载体,并转化小麦幼胚,经ＰＣＲ－Ｓｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,初步确     

影响外源基因在原核中表达水平因素分析

为了预测外源基因在Ｅ．Ｃｏｌｉ中的表达水平,我们分析外源基因在固定载体Ｐｂｖ２２０中表达水平的实验数据,结合有关参考资料,提出预测外源基因表达水平的一组判据：在ＡＵＧ附近的ＲＮＡ二级结构能量,ＡＵＧ附近的密码子自适应指数,ＲＢＳ和ＡＵＧ距离及ＡＵＧ附近的构象。在表达实验前可利用这些判据对外源基因作改造以获得高效表达     

玉米转座因子Ac在单倍体烟草中转座的研究

把玉米转座因子Ａｃ插入花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子和链霉素抗性基因（ＳＰＴ）之间，构建带嵌合基因Ａｃ∷ＳＰＴ的双元载体ｐＳＡＣ１１。从普通烟草的花粉植株取单倍体组织，通过农杆菌转化法分别转化嵌合基因Ａｃ∷ＳＰＴ和Ａｃ∷ＧＵＳ（来自双元载体ｐＳＬＪ７２１），得到单倍体转基因植株。对转化Ａｃ∷ＳＰＴ的单倍体叶组织进行链霉素抗性分析，同时对转化Ａｃ∷ＧＵＳ的单倍体作ＧＵＳ活性鉴定，分别检测到Ａｃ从Ａｃ∷ＳＰＴ和Ａｃ∷ＧＵＳ处切离。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明，Ａｃ切离后在单倍体基因组的不同位点整合。上述烟草单倍体的转化体系的建立以及对Ａｃ因子转座的分析，将有助于在单倍体细胞中进行转座因子标签研究。     

马铃薯GBSS基因5′侧翼区调控作用的研究

将０．４、０．８、１．６、２．９ｋｂＧＢＳＳ基因的５′侧翼区与ＧＵＳ基因融合,构建了双元表达载体。０．８ｋｂＧＢＳＳＧＵＳ通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．ｃｖ．Ｄｅｓｉｒｅｅ）。ＸＧｌｕｃ染色及ＰＣＲ结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,ＧＵＳ表达用荧光进行定量检测,结果显示,２．９、１．６、０．４ｋｂＧＢＳＳＧＵＳ的表达均以块茎明显高于茎段,达２～１０倍。０．８、１．６、２．９ｋｂＧＢＳＳＧＵＳ表达高于０．４ｋｂＧＢＳＳＧＵＳ。蔗糖浓度的升高可诱导ＧＢＳＳＧＵＳ的表达,而光照抑制了ＧＢＳＳＧＵＳ的表达。     

马铃薯GBSS基因5‘侧翼区调控作用的研究

将０．４、０．８、１．６、２．９ｋｂＧＢＳＳ基因的５＇侧翼区与ＧＵＳ基因融合,构建了双元表达载体。０．８ｋｂＧＢＳＳ－ＧＵＳ通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯。Ｘ－Ｇｌｕｃ染色及ＰＣＲ结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,ＧＵＳ表达用荧光进行定量检测,结果显示,２．９、１．６、０．４ｋｂＧＢＳＳ－ＧＵＳ的表达均以块茎明显高于茎段,达２￣１０倍。     

用基因枪法将GUS基因导入烟草脱外壁花粉及其瞬间表达

以β－葡糖苷酸酶（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ,ＧＵＳ）基因作为报告基因,用基因枪法将其导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）脱外壁花粉和作为对照系统的完整花粉,探讨了启动子及不同轰击条件对外源基因瞬间表达的影响,比较了二者的转化频率。结果表明：玉米花粉特异启动子能启动ＧＵＳ基因在脱外壁花粉和完整花粉中表达,而ＣａＭＶ３５Ｓ启动子则不能。靶距离越近,着弹率越高,ＧＵＳ基因瞬间表达频     

种子特异表达ipt转基因棉花根和纤维的改变

将种子特异表达的菜豆蛋白启动子（Ｐｈ／Ｐ）与ｉｐｔ基因融合,构建了植物表达载体。该载体含有由３５Ｓ启动子驱动的ｇｕｓ报告基因。应用该载体通过花粉管通道法转化棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）,种子萌发后剪取幼根进行ＧＵＳ染色,获得ＧＵＳ阳性植株２３棵。ＰＣＲ检测证明有３棵ＧＵＳ阳性植株中含有Ｐｈ／Ｐ－ｉｐｔ基因,并进一步用地高辛标记的ＤＮＡ探针作杂交验证了上述结果。分析表明２棵转基     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟…

以玉米黄化苗为材料,利用ＰＣＲ技术扩增了玉米１９ｋＤａ醇溶贮藏蛋白基因（ｚｅｉｎ）起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的－１￣－６９４片段具有１９ｋＤａ Ｚｅｉｎ启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达９０％以上。将启动子插入ｐＰＫＧＴ的ＧＵＳ基因及ＮＯＳ终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草,得到了转化植株。转化的烟草的ＰＣＲ扩增及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明目的片段已整合到     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica     

利用烟草表达人源性胰岛素样生长因子1

构建了由花椰菜花叶病毒35S启动子引导人源性胰岛素样生长因子1基因(igf-1)的表达载体pCAM-BIA1301-35S promoter-igf-1-nos,并利用根癌农杆菌LAB4404介导,将其导入烟草。经潮霉素抗性筛选、GUS检测和PCR鉴定,获得17棵转基因植株。RT-PCR分析结果显示,igf-1能够在转基因烟草中正常转录。本试验为利用烟草以及其他双子叶植物高效表达便于分离纯化的IGF-1药用蛋白研究奠定了重要的基础。     

表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

Stable and specific expression of 4-coumarate:coenzyme A ligase gene (4CL1) driven by the xylem-specific Pto4CL1 promoter in the transgenic tobacco

The ability of 4-coumarate:coenzyme A ligase promoter from Populus tomentosa (Pto4CL1p) to drive expression of the GUS reporter gene and 4-coumarate:coenzyme A ligase gene in tobacco has been studied using transgenic plants produced by Agrobacterium-mediated transformation. Intense GUS histochemical staining was detected in the xylem of stem in transgenic tobacco plants carrying the 1140 bp Pto4CL1p promoter. To further investigate the regulation function of the tissue-specific expression promoter, Pto4CL1p, a binary vector containing Pto4CL1p promoter fused with 4CL1 gene was transferred into tobacco. The activity of the 4CL1 enzyme doubled in the stems of transgenic tobacco but did not increase in the leaves. The content of lignin was increased 25% in the stem but there was no increase in the leaves of transgenic tobacco.     

转人α-乳清白蛋白基因烟草中半胱氨酸含量的提高

将人α-乳清白蛋白基因构建到植物表达载体上,通过农杆菌介导采用叶盘法将人α-乳清白蛋白基因导入到烟草中,经过PCR和Southern blot分析表明:人α-乳清白蛋白基凶已经整合到烟草基因组中;经过RT-PCR葙GUS组织化学染色证明:人α-乳清白蛋白基因得到了表达.测定了9株转基因烟草叶片半胱氨酸含量,大部分植株有着明显的提高,最高幅度达到了318.02%,半胱氨酸含量平均提高了166.40%.     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。