牙龈卟啉单胞菌蛋白酶及疫苗的研究进展

牙龈卟啉单胞菌 (P g) ,革兰阴性厌氧菌 ,是人类牙周炎的主要致病菌[1] 。动物实验表明它在小鼠、大鼠和灵长类动物的龈下定植与牙周炎的发生和进展相关。P g可以调整真核细胞信号转导途径 ,为了满足新陈代谢的需要 ,P g基因表达的调节可以控制在转录水平。证据表明 ,P g的感染会导致严重的全身系统疾病如心血管疾病和分娩早产儿。P g含有大量毒性因子[2 ] ,如菌毛 ,血凝素[3 ] ,脂多糖等 ,其中Arg、Lys样半胱氨酸蛋白酶在牙周致病作用中占据了一个重要地位 ,他们通过激活宿主前体酶 ,例如 :血纤维蛋白酶原 ,或通过暴露细胞隐位及改变血…     

牙龈卟啉单胞菌相关致病因子的研究进展

牙龈卟啉单胞菌是一种生长于口腔内的革兰阴性厌氧茵.它能够利用脂多糖、荚膜多糖、菌毛、牙龈蛋白酶等一系列致病因子,侵袭局部牙周组织并逃避宿主的免疫防御机制,是诱发牙周炎的重要因素之一,引起了学者们的广泛关注.因此,探讨牙龈卟啉单胞菌的致病因子对于牙周炎的防治具有重要意义.     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌生长抑制作用

目的探讨牙龈卟啉单胞菌血凝素2（Porphyromonas gingivalis hemagglutinin-2,PgHA-2）的氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）摄取氯化血红素生长的影响。方法合成多肽DHYAVMISK（肽1）,DEYAVMISK（肽2,肽1中第2位氨基酸突变为谷氨酸）,ALHPDHYLI（肽3,HA-2结合位点不相关多肽）。将肽l、肽2、肽3分别与氯化血红素琼脂糖珠预孵育,加入Pg重组血凝素2（Porphyromonas gingivalis recombinant HA-2,PgrHA-2）,收集与氯化血红素结合的PgrHA-2,SDS—PAGE电泳,分析多肽对PgrHA-2与氯化血红素结合的抑制作用。肽1、肽2、肽3与氯化血红素预孵育后,加入到CDC液体培养基中培养Pg,测定菌液A600值,分析多肽对Pg生长的抑制作用。结果肽1浓度依赖性抑制PgrHA-2与氯化血红素结合,而肽2和肽3对PgrHA-2与氯化血红素的结合无抑制作用。在24、48和72h时间点,肽1组的A600值较肽2、肽3和PBS组明显降低（P〈0．05）。结论本研究表明PgHA-2氯化血红素结合位点多肽DHYAVMISK与Pg竞争结合氯化血红素,抑制Pg的生长,为开发新的牙周病防治方法奠定基础。     

抗牙龈卟啉单胞菌血凝素2单克隆抗体的制备

目的制备抗牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-2,HA-2)的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。方法用重组HA-2(recombinant HA-2,rHA-2)免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞.用ELISA方法测效价。结果获得1株能够高效识别rHA-2的mAb,命名为4F11。此单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1,效价达1?106。结论成功制备了重组牙龈卟啉单胞菌血凝素2的单克隆抗体mAb.将进一步用于牙龈卟啉单胞菌的诊断,并为牙周疾病的治疗研究奠定基础。     

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡与阿尔茨海默病的相关性研究进展

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是牙周炎的主要致病菌,在其生长过程中可产生大量毒力因子。P. gingivalis及其毒力因子不仅可引发牙周组织的破坏,还可扩散至全身并影响包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)在内的多种系统疾病的发生、发展。P. gingivalis外膜囊泡包含亲本细菌的大量毒力因子且体积小,更易扩散至远处组织和器官。近期研究发现,P.gingivalis外膜囊泡可能在诱发神经炎症和促进AD的发生、发展中起重要作用,但具体机制尚不清楚。本文就P. gingivalis外膜囊泡的发生与调控、所含主要毒力因子及其与AD的关系进行综述,以阐明牙周炎与AD相关的生物学机制。     

牙龈卟啉单胞菌酪氨酸激酶致病性的分子机制

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis）酪氨酸激酶（Ptk1)致病性的分子机制。方法 采用重组PCR技术构建P. gingivalis野生菌株ATCC 33277的Ptk1单基因缺失的突变菌株（ΔPtk1），通过Real-time PCR技术检测并比较参与调控P. gingivalis（野生型P. gingivalis ATCC 33277与突变型ΔPtk1）细胞外多糖（extracellular polysaccharides,EPS）合成的转录因子SinR的表达情况，同时采用激光共聚焦显微镜观察Ptk1缺失的突变菌株与野生型菌株EPS的形成情况，最后通过ELISA试剂盒检测并比较Ptk1缺失的突变菌株与野生型菌株白细胞介素-1β(IL-1β)表达情况。结果 与野生菌株P. gingivalis ATCC 33277比较，Ptk1单基因缺失的突变菌株转录因子SinR的表达量没有显著变化（t=–1.572,P>0.05）;ELISA检测发现，Ptk1单基因缺失的突变菌株IL-1β的表达量较野生型菌株显著下降，差异有统...     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2与氯化血红素结合位点分析

目的 通过竞争性ELISA方法明确牙龈卟啉单胞菌血凝素2(Porphyromonas gingivalis hemagglutinin-2,Pg HA-2)与氯化血红素结合的多肽位点,为牙周病保护性抗体的制备奠定基础.方法 人工合成疑为Pg HA-2氯化血红素结合位点的多肽片段,制备抗Pg HA-2单克隆抗体(MAb QB),通过间接竞争性ELISA,进一步分析血红素特异性结合位点.结果 Pg HA-2氯化血红素结合位点的氨基酸序列为DGFPGDHYAVMISK.MAb QB可以抑制Pg HA-2与氯化血红素结合.结论 明确了Pg HA-2氯化血红素结合位点的氨基酸序列,确定了Pg HA-2氯化血红素结合位点的位置.为今后Pg HA-2氯化血红素结合位点的鉴定、功能结构区分析和多肽疫苗的制备奠定基础.     

牙龈卟啉单胞菌编码基因重注释研究

为了确保牙龈卟啉单胞菌生物大分子信息的准确性,对NCBI数据库中的3株牙龈卟啉单胞菌的注释信息进行研究。首先,准备好蛋白质编码与非编码序列正负样本,用基于Z曲线理论的Fisher判别法对正负样本集进行训练,确定一个判断ORF编码或非编码的阈值t0,由阈值作为判别条件来识别所有的ORFs,判断基因片段是否具有编码蛋白质的功能,由此阈值为判别标准排除掉3株牙龈卟啉单胞菌基因组中错误的基因注释信息。然后,用Prodigal基因预测软件对牙龈卟啉单胞菌进行基因预测,基因预测结果与原始功能已知基因进行比对,挑选出具有不同5’终端的ORFs,将这些具有不同5’终端的ORFs与功能已知的基因片段进行比对,找到重叠率小于20%的候选基因。最后,对这些候选基因用Blast进行序列比对找到满足条件的新基因,并为这些新基因添加功能注释信息。基于以上方法共排除了117个非编码的开放式阅读框,并找到了30个NCBI数据库中缺失的编码蛋白质的新基因。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌超微结构观察

目的 探查具有不同粘附、侵入能力的各fimA基因型P.gingivalis菌体表面结构特点.方法 选取临床培养的经PCR鉴定、筛选的fimA基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型P.gingivalis野生菌株,制备超薄切片,在透射电镜下进行菌体表面结构观察.结果 fimA基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型P.gingivalis的菌毛存在差别：Ⅰ型和Ⅱ型菌体表面有放射状菌毛,Ⅱ型略显致密,Ⅳ型表面未见明显菌毛.同时也观察到各型荚膜存在差别：Ⅰ型荚膜最厚,Ⅳ型荚膜较薄,Ⅱ型荚膜最薄.结论 fimA基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型P.gingivalis的菌毛和荚膜存在较大差别,推测其粘附、侵入或其它致病能力的差异可能不仅与菌毛有关,还与荚膜或其它因素有关.     

牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA基因型在牙周病患者中的分布情况

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌FimA基因型在牙周患者的分布情况。方法：采用PCR技术对40例牙周患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌及其基因型进行检测。结果：牙龈卟啉单胞菌在牙周患者的牙周袋内检出率为87．5％,牙龈卟啉单胞菌FimA各基因型在牙龈卟啉单胞菌携带者的检出率分别为：I型22．9％,Ⅱ型60．0％,Ⅲ型17．1％,Ⅳ37．1％．V型未检出;基因I型在牙周袋内未单独检出,与基因Ⅱ型混合感染。结论：牙龈卟啉单胞菌FimA基因Ⅱ型和Ⅵ型是牙龈卟啉单胞菌在牙周病损部位的主要定植菌,两基因型可能与牙周病的发生发展有关。     

天然药物对牙龈卟啉单胞菌的体外抗菌研究

目的 观察天然药物对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）生长的影响,筛选抗菌作用最强的天然药物。方法 选用7种天然药物,采用液体稀释法,结合吸光度测定以确定7种天然药物对P.gingivalis的最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）。结果 黄芩、三七、白芷、大黄、五倍子、血藤和川芎对P.gingivalis的MIC值分别为1、1、0.5、0.0156、1、0.5、0.125 mg/ml;MBC值分别为1、1、0.5、0.0625、1、1、0.25mg/ml。结论 7种天然药物对P.gingivalis的生长均表现出明显的抑制作用,大黄的抑菌作用最强,川芎其次。     

20种中药提取物对牙龈卟啉单胞菌抑制作用的体外研究

目的筛选评价20种中药提取物对牙龈卟啉单胞菌抑制作用。方法选择20种有较强抑菌作用及清热解毒作用的中药提取物,采用杯碟法进行体外抑菌试验,比较各中药对牙龈卟啉单胞菌的抑菌环直径和最低抑菌浓度(MIC)。结果水煎剂中黄连、乌梅、五味子、五倍子和黄芩的MIC为0.0488~1.5625mg/mL。油剂中丁香油、香薷油的MIC为0.3906~1.5625mg/mL。结论本实验选择的20种中药提取物中香薷油、黄连、乌梅、五味子、五倍子和黄芩的抑菌敏感度最高。     

具有抗牙龈卟啉单胞菌功效的天然植物提取物在牙周炎防治中的研究进展

牙周炎是影响人类健康的一种慢性感染性疾病,牙龈卟啉单胞菌被认为是其重要致病菌之一,以抗牙龈卟啉单胞菌为目标的牙周炎防治策略受到关注.传统抗菌药物已广泛应用于牙周炎的临床防治,但其局限性仍不可忽视.多种天然植物提取物已被报道具有优越的抗菌性能且不易产生耐药性等独特优势,有望为牙龈卟啉单胞菌抗菌防治提供新的策略.本文回顾总结了具有抗牙龈卟啉单胞菌功效的天然植物提取物对牙周炎的防治效果及其机制,在此基础上纳入了天然植物提取物与抗菌剂联用和(或)结合纳米技术的最新研究进展,以期为天然植物提取物抗菌相关研究和牙周炎的防治策略提供通用思路和理论基础.     

多肽免疫抑制牙龈卟啉单胞菌引起的小鼠感染及牙槽骨吸收作用的研究

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)血凝素2(hemagglutinin-2,HA-2)的氯化血红素结合位点多肽作为抗原免疫小鼠,对降低P.g感染后毒性和抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用。方法将多肽与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联作为抗原免疫BALB/c小鼠。P.g国际标准菌株ATCC33277厌氧培养,皮下注射菌液,监测小鼠脓肿的大小及转归,评价多肽对P.g皮下感染的保护作用;口腔接种细菌感染小鼠,检测小鼠牙周炎牙槽骨吸收量,评价其对于P.g引起的牙周炎牙槽骨吸收的保护作用。结果多肽DGFPGDHYAVMISK作为抗原免疫小鼠可减小小鼠皮下接种P.g处形成脓肿的大小,并加快皮下脓肿的愈合;可抑制口腔感染P.g后小鼠牙周炎模型牙槽骨的吸收。结论多肽DGFPGDHYAVMISK免疫小鼠对P.g感染小鼠具有一定的保护作用;可减少小鼠牙周炎模型牙槽骨的吸收。为开发新的牙周病防治方法奠定基础。     

牙龈卟啉单胞菌HA2基因和白细胞介素IL-15基因重组质粒的构建

构建抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15,体外检测其在293T细胞的表达。以HA2基因(牙龈卟啉单胞菌牙龈素—血凝素基因编码区的核心功能区)为目的基因与IL-15基因为免疫佐剂构建真核表达质粒,用Lip2000介导瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测目的基因mRNA水平及酶联免疫吸附试验检测IL-15蛋白表达水平。重组质粒p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15经酶切及DNA测序鉴定构建正确,转染的293T细胞能够检测到目的基因的表达,也可以检测到IL-15蛋白的表达。说明我们成功构建了真核共表达质粒pVAX1-HA2和p VAX1-HA2/IL-15,为下一步研制抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌及其细胞外膜泡多克隆抗体的比较研究

分别制备牙龈卟啉单胞菌４７Ａ－ １ 及其膜泡的多克隆抗体,并用间接免疫荧光法对６７ 个临床标本进行检测。结果经统计学检验,两种抗体显著相关,Ｐ＜ ０．０１ ,符合率为８２．１ ％ ;膜泡抗体的检出率高于菌体抗体,Ｐ＜０．０５ ;膜泡抗体相对于菌体抗体的敏感性为９３．５ ％ 。膜泡抗体与牙龈卟啉单胞菌以外的其他口腔细菌无交叉反应,说明膜泡抗体的特异性较强。     

牙龈卟啉单胞菌诱导T淋巴细胞活化、凋亡的体外研究

目的检测牙龈卟啉单胞菌对人外周血中T淋巴细胞活化及凋亡的作用,并检测Fas/FasL在牙龈卟啉单胞菌(Porphyrom onas gingivalis,Pg)诱导的T淋巴细胞凋亡中的表达。方法选取10例全身及牙周组织健康受试者,分离外周血中T淋巴细胞,在有/无Pg情况下培养0~96 h,用荧光探针(Annexin V-FITC、PI、CD69)及特殊的单克隆抗体(Fas、FasL)进行标记,并进行流式细胞仪检测。结果 CD69+淋巴细胞+Pg组Annexin V+/PI-细胞百分数在各个时间点上都明显高于T淋巴细胞+Pg组(P0.01)。Fas和FasL的表达量明显上调。用抗Fas单克隆抗体阻滞Fas-FasL相互作用导致T细胞凋亡的明显减少,百分比为(20.56±2.43)%,未加抗体的为(50.41±2.68)%。但残余的细胞凋亡活动与阴性对照相比仍高。结论 Pg能够诱导人外周血中T淋巴细胞活化,并且能够通过活化促进其凋亡,Pg诱导T淋巴细胞凋亡主要通过Fas-FasL途径,并具有时间依赖性。     

牙菌斑链球菌与牙龈卟啉单胞菌相互作用的研究

牙菌斑生物膜是牙周病最主要的致病因素。早期定植菌链球菌与晚期定植菌牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的相互作用复杂多样,而牙龈卟啉单胞菌是重要的牙周致病菌,本文就链球菌与牙龈卟啉单胞菌的相互作用作一综述。     

多肽内切酶鉴定牙龈卟啉单胞菌血凝素2结合位点

目的利用多肽内切酶分析牙龈卟啉单胞菌凝血素2(Porphyromonas gingivalishemagglutinin-2,PgHA-2)与氯化血红素结合位点的氨基酸序列。方法Endoproteinase Lys-C多肽内切酶水解获得与氯化血红素结合的功能性的多肽片段,质谱技术鉴定多肽片段的氨基酸序列。结果质谱鉴定与氯化血红素结合的多肽片段的氨基酸序列为YAVNDGFPGDHYAVMISK。结论进一步明确了HA-2与氯化血红素结合位点的氨基酸序列,为牙周病的预防和治疗方法的改进奠定基础。