酵母pac—1基因的克隆、序列分析和在大肠杆菌中的高效表达及活性测定

粟酒裂殖酵母菌 (Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ)的 ｐａｃ 1基因于 1991年Ｙｕｉｃｈｉｌｉｎｏ等首次报道。在温度敏感型的酵母突变体中 ,ｐａｃ 1基因是一个多拷贝阻遏子 ,它使酵母在限制温度培养条件下的减数分裂不受调控 ,对酵母的生长过程起着重要的调节作用。该基因有一个编码 36 4个氨基酸的开放阅读框 ,编码产物的羧基端与大肠杆菌核糖核酸酶Ⅲ有2 5 %的同源性。通过酶活性测定 ,已经确定它是一类依赖ｄｓＲＮＡ的核糖核酸酶 ,具有降解ｄｓＲＮＡ的功能[1,2 ] 。由于大多数植物病毒为ＲＮＡ病毒 ,因此无论它的基…     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

来源于Aspergillus candidus的乳糖酶基因的克隆及序列分析

从一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列(EMBL ACCESSION No. AJ431643),序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3458bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长3015bp,共编码1005个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽序列,氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因与不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现,该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC 20423的乳糖酶序列同源性较高,但其在酶学性质上更优于后者,亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。      

粟酒裂殖酵母钙调素基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的分离纯化

用带有粟桌酒裂殖酵母钙调索基因的质粒PEC/PCA和质粒PSB6来转化大肠杆菌SB1,扩增培养后破碎离心,上清液经Phenyl-SepharoseCL－4B柱、DEAEcellulose-52柱、SephedesG－75柱分离,得到纯化的表达产物,此产物经SDS—PAGE电泳鉴定和对环核苷酸：酷酶（cyclicnucleotidephosphodiesterase,PDE）活性的激活鉴定,确定为酵母钙调素,且其分产量小于猪脑钙调素。     

小球藻病毒基因调控序列在大肠杆菌和真核藻中的调控活性研究

以小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因(amt)和主要外壳蛋白VP54基因的5′上游调控序列构建大肠杆菌和真核藻转化载体。以P_RP_L及CaMV35S启动子为阳性对照,研究了小球藻病毒来源的两种调控序列在E.coli和真核藻细胞中的启动活性。发现P_AMT在4种E.coli菌株中都具有极强的调控活性,启动Luc基因表达而产生的酶活性高于P_RP_L 50～400倍;P_VP54在DH5α中也具有较强的启动活性。同时PAMT在两种小球藻中启动GUS基因瞬时表达的能力也明显高于CaMV35S启动子,表明它们有可能在真核藻类遗传转化中具有很好的应用前景。     

原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

以黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因,重组质粒pLZS1外源片段为1.1kb,将pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5,得到了克隆子XA5-5(pLZS1).以水杨苷为底物,XA5-5(pLZS1)的酶活性大大高于E.Coli JM83(pLZS1).并且质粒在XA5-5中能相对稳定地存在.初步结果表明,所克隆的基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力,并可以在一定程度上降低XA5-5中酶与pNPG底物的亲和力,使其酶活减小.     

枯草芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(bglS) 在酵母菌中的克隆与表达

将大肠杆菌质粒pFG1中含枯草芽胞杆菌卢β-1,3—1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的2.7kb EcoRI片段克隆到大肠杆菌,酵母菌穿梭质粒上组建成杂种质粒YCSH,转化S.cerevisiae并得到表达。两种不同方向的插入子(YCSH 1和YCSH 5)在酵母菌中表达出的β-1,3-1,4葡聚糖酶活性相差2．3倍。根据酶作用底物专一性测定和酶反应的最适pH分析表明：YCSH中bglS基因产物与出发菌株B．Subtilis 1．88的基本酶学特性完全相同,但YCSH中bglS基因在酶母中的表达水平远比大肠杆菌中低     

胆固醇氧化酶基因的克隆及在E.coli中的表达

根据NCBI中报道的BrevibacteriumsterolicumATCC21387胆固醇氧化酶基因序列,采用PCR方法以Brevibacteriumsp.DGCDC-82的基因组为模板,扩增得到了编码胆固醇氧化酶的基因,该基因与来源于BrevibacteriumsterolicumATCC21387的胆固醇氧化酶基因(choB)同源性为98%。将得到的基因定向克隆到pET28a载体中,转化至含有编码argU和proL基因的大肠杆菌BL21-CodonPlus(     

花生类受体蛋白激酶基因AhBAK1的克隆及原核表达

BAK1是富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶,参与调控植物先天免疫反应过程中的程序性细胞死亡过程。实验室已有的花生铝胁迫转录组数据揭示AhBAK1为铝胁迫响应基因。为研究其在花生抗铝机制中的作用,该文分析了铝胁迫下AhBAK1在花生耐铝品种‘99-1507’和铝敏感品种‘中花2号’(‘ZH2’)根尖中的转录变化,采用RT-PCR技术进行扩增AhBAK1的完整CDS序列,并对序列特征进行了分析。结果表明:AhBAK1显著响应铝处理,且在‘99-1507’中有着更强的诱导表达; AhBAK1包括625个氨基酸残基,属富亮氨酸重复区类受体激酶,具跨膜域和蛋白激酶催化结构域,不存在信号肽,预测定位于细胞质膜;我们进一步构建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组质粒,体外诱导表达出约70kD可溶性蛋白,经凝胶亲和层析纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western Blot)验证正确的重组蛋白。为进一步研究AhBAK1的生物学功能和生化功能奠定了基础。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

水稻OsMBF1c基因的克隆及表达分析

多蛋白桥联因子1(multi protein bridging factor 1, MBF1)在植物应对逆境胁迫中起着重要的作用,而对于水稻中MBF1是否参与重金属胁迫响应机制目前尚未见相关报道。为了揭示水稻MBF1家族与重金属胁迫的相关性及其潜在作用机制,该研究利用PCR技术克隆水稻OsMBF1c基因的全长编码序列,通过生物信息学对基因功能进行分析和预测,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析其在镉(Cd)胁迫下的表达特征。结果表明:(1)OsMBF1c的全长编码序列为468 bp,共编码155个氨基酸,相对分子量为16.154 kDa。(2)OsMBF1c与大麦TdMBF1a.1亲缘关系最近,具有光、厌氧等环境因子诱导相关的顺式调节元件。(3)重金属Cd可诱导OsMBF1c表达且在时间上和组织中的表达水平具有特异性,100 μmol·L^-1 Cd 处理1 h 后,地上部分OsMBF1c表达量明显上调,为对照组的7倍; 100 μmol·L^-1 Cd 胁迫处理6 h后,根部OsMBF1c表达量上调为对照组的3倍。该研究结果进一步完善了非生物胁迫下MBF1家族的生物学功能研究。     

Ralstonia eutropha CH34酯酶基因的克隆和序列分析

采用含α 乙酸萘酯和固兰RR的表面琼脂法从RalstoniaeutrophaCH34的基因文库中筛选酯酶基因estA ,对含有estA的 1 7kbDNA片段的核甘酸序列分析表明 ,该基因全长82 5bp,编码由 2 75个氨基酸组成的EstA蛋白 ,分子量为 30 785D。经推导氨基酸序列的同源性分析 ,发现EstA与参与芳香化合物代谢中间位裂解途径的水解酶有很高的同源性。     

松材线虫galectin-1基因的克隆、原核表达和表达模式分析

【目的】galectin-1是凝集素的一种,广泛存在于各种生物体内,在生长发育、免疫调节方面起重要作用。本研究克隆和表达了松材线虫的galectin-1蛋白,并分析了各个龄期的表达量。【方法】设计引物,扩增松材线虫的galectin-1基因,使用双酶切的方法连接p ET-28a载体和目的基因,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆;在不同温度下,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检验蛋白表达情况;采用RT-PCR技术检验松材线虫各个龄期galectin-1基因的表达情况。【结果】由SMART和Predict Protein软件分析可知,该蛋白有2个结构域,并且主要由无规卷曲和β折叠构成;生物学信息分析显示,松材线虫的galectin-1与小卷蛾斯氏线虫的相似性更高;与日本血吸虫相比,线虫能很好地聚集在一个分支上。Western blot检测纯化蛋白大小与查询所得蛋白分子质量一致。RT-q PCR结果显示,以繁殖型2龄松材线虫(L_2)为对照,galectin-1基因在繁殖型3龄(L_3)、繁殖型4龄(L_4)、扩散型3龄(L_(Ⅲ))和扩散型4龄(L_(Ⅳ))松材线虫中的表达量高,尤其是在LⅢ中的表达量最高;雌雄成虫没有显著性差异。【结论】松材线虫的galectin-1基因在p ET-28a原核表达系统中呈可溶性表达,在不同龄期的表达量有差异。本研究为进一步研究松材线虫的galectin-1基因奠定了基础,为松材线虫的防治提供了新的方向。     

鼠mPC-1基因的克隆与特性分析

为深入研究人前列腺癌相关基因PC-1的生物功能和进化保守状况,从小鼠肾脏中克隆了全长cDNA序列,命名为mPC-1（GenBank Acc No.AY048852）.mPC-1基因cDNA全长为2 193 bp,主要定位于小鼠染色体3A1-A2区域.mPC-1基因最大开放阅读框编码的蛋白质由224个氨基酸组成,与人PC-1蛋白编码区存在82%的序列一致性,含有coiled-coil结构域和PEST结构域.生物信息学分析表明,由6个外显子组成的mPC-1基因与mD52高度同源,其中,第一外显子代表该基因的特异性序列,实验证据显示mPC-1基因具有自己的启动子,推测mPC-1与小鼠mD52可能是重叠基因.对小鼠20种组织器官和不同发育阶段的胚胎组织cDNA的RT-PCR检测证实,该基因主要在前列腺、肾和眼组织中表达,在胃和平滑肌中有少量表达,在其他组织中表达很弱或不表达.而mD52基因则几乎广泛存在于小鼠的各个组织器官中,因此,两个基因虽然序列上高度重叠却是独立调控的.综上所述,mPC-1基因可能是一个与人PC-1基因结构功能类似的新基因.     

人血管内皮细胞生长因子在毕赤酵母中的高效表达

血管内皮细胞生长因子 (Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃ ｔｏｒ,简称ＶＥＧＦ)是一类多功能细胞因子 ,特异地作用于血管内皮受体ＫＤＲ和Ｆｌｔ 1,促进新生血管形成并增加微血管的渗透性[1] 。ＶＥＧＦ在生理和病理 ,如肿瘤血管发生、伤口愈和、类风湿性关节炎、胚胎发育及冠心病等过程中起着非常重要的作用。天然ＶＥＧＦ是由两条糖蛋白链形成的二聚体。目前发现ＶＥＧＦ至少有 5种亚型 ,根据单体残基数不同分别为ＶＥＧＦ12 1,ＶＥＧＦ14 5,ＶＥＧＦ165,ＶＥＧＦ189和ＶＥＧＦ2 0 6,其中ＶＥＧＦ12 1和ＶＥＧ…