重组可溶性TRAIL的表达与生物学活性

研究重组可溶性TRAIL的抗肿瘤生物学活性。采用基因分子生物学方法构建重组可溶性TRAIL的表达载体,建立大肠杆菌表达菌株,采用柱层析等方法获得纯化的重组可溶性TRAIL;采用流式细胞术、细胞活性测定法和体内药效学实验分析重组可溶性TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性。结果表明重组可溶性TRAIL在体外可诱导人白血病细胞和肝癌细胞凋亡,凋亡率达50%以上。中枢神经系统的肿瘤细胞对重组可溶性TRAIL不敏感。重组可溶性TRAIL在体内能显著抑制人非小细胞肺癌细胞在小鼠体内生长,抑制率达70%以上。结论为研究制备的重组可溶性TRAIL能在体内外杀死多种肿瘤细胞,具有显著的临床应用前景。     

TRAIL抗肿瘤的优化研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员。因其具有选择性杀伤绝大多数肿瘤细胞而对人体正常细胞无明显细胞毒性的特性而被广泛研究,并已有相关制剂进入临床抗肿瘤研究。虽然TRAIL在体内外实验中均展现出良好的抗肿瘤效果,前期临床研究结果也表明了其相对安全性,但其临床抗肿瘤效果却不太理想。总结其临床效果差的主要原因,可能有体内稳定性差、肿瘤靶向性差、肿瘤获得性耐受等。对于TRAIL临床疗效差的问题,许多针对性的研究也相应开展,目前已有不少报道表明通过一些合理的优化方式有可能解决上述问题。我们从TRAIL的基因治疗、重组蛋白及死亡受体抗体治疗、TRAIL联合用药治疗及其他治疗方法等方面,简要综述TRAIL在抗肿瘤方面的应用及其应用中的优化。     

人HPPCn重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测

HPPCn是一种新的肝细胞刺激因子,获得较高纯度的具有生物活性的HPPCn蛋白对研究其生物学功能具有重要意义。HPPCn在重组质粒PET-24a(+)/HPPCn中,诱导表达产物主要以包涵体形式为主。为优化表达条件,运用冷休克表达载体pColdⅡ和无缝克隆技术获得重组质粒pColdⅡ/HPPCn,分别对诱导温度、时间、分子伴侣等诱导条件进行筛选,镍离子柱亲和层析纯化,Western blot分析目的蛋白特异性,不同浓度人HPPCn重组蛋白(0、10、100ng/ml)刺激SMMC7721细胞,免疫细胞化学方法测定Brdu掺入、PCNA表达变化。目的蛋白在培养温度为16℃,终浓度为0.1mmol/L的IPTG过夜诱导时为可溶性表达,最终得到人重组HPPCn蛋白纯度为94.88%,人HPPCn重组蛋白可刺激SMMC7721细胞Brdu掺入增加、PCNA表达水平上调,其刺激作用具有量效关系。通过冷休克表达系统获得可溶性表达的人重组HPPCn蛋白,其具有促进SMMC7721细胞增殖的生物学功能,为深入研究HPPCn的作用机制提供了技术条件。     

可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL~100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。     

阿霉素脂质体的制备及其体外抗肿瘤活性的初步研究

目的:应用超声波分散法制备脂质体阿霉素,并比较脂质体阿霉素与游离性阿霉素抗肿瘤活性。方法:以卵磷脂和胆固醇为原料,将阿霉素包封于脂质体中,采用超声分散法制备脂质体阿霉素,对其在290-700nm范围内进行紫外扫描,用SephedexG-50柱分离脂质体阿霉素并计算其包封率。以昆明种小鼠为载体建立肿瘤模型(S180型肉瘤)和细胞荧光染色法研究脂质体阿霉素的抗肿瘤活性,以ZITA SIZER3000型表面电位与粒度测定仪测定其粒径分布。结果:脂质体阿霉素在480nm处有最大吸收峰值,包封率达91.3%,细胞荧光染色显示,脂质体及游离型阿霉素均对S180细胞有明显的抑制作用。结论:此法制备的脂质体阿霉素包封率高,粒径分布集中,脂质体阿霉素较游离型阿霉素有较强的抗肿瘤活性剂及较低的细胞毒作用,对阿霉素的临床应用有一定的参考价值。     

射干苷元衍生物的制备及其体外抗肿瘤活性研究

以射干苷元为先导化合物合成了5个衍生物,并以射干苷元为对照,考察化合物体外抗肿瘤的活性,为研发新抗肿瘤药物提供依据。化学试验分别通过磺化反应、甲基化、乙基化反应合成化合物1～5,并根据红外、紫外、质谱、核磁等数据确定各化合物的结构,分别是射干苷元-5'-磺酸钠(1)、4',7-二甲基射干苷元(2)、4',7-二甲基射干苷元-5'-磺酸钠(3)、4',7-二乙基射干苷元(4)、4',7-二乙基射干苷元-5'-磺酸钠(5),其中化合物5为新化合物;活性研究表明各化合物组对HCT116、A549、HepG2细胞体外增值均有不同程度的抑制作用,效果明显强于同等剂量的射干苷元组,特别是化合物3对A549的IC50为33. 67μM,化合物5对HCT116和HepG2的IC50分别为24. 71和32. 42μM,抗肿瘤活性明显,具有很好的开发利用价值。     

叶酸-阿霉素连接物的制备及其抗肿瘤活性研究

目的:合成具有酸敏特性的叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,并观察其抗肿瘤活性以及对肿瘤细胞的靶向性.方法:首先将叶酸与氨基己酸连接,然后利用腙键与阿霉素连接,采用核磁共振、质谱等方法鉴定其结构;采用MTT法观察连接物对叶酸受体袁达阳性的口腔表皮样癌细胞KB细胞及叶酸受体表达阴性肺癌A549细胞的毒性作用.结果:在氮羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的催化作用下,合成了叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,波谱分析提示为目标产物.与游离阿霉素相比,连接物对KB细胞具有更强的细胞毒性,而且细胞毒性作用可被外源性叶酸抑制;而连接物对A549细胞的毒性弱于游离阿霉素,而且外源性游离叶酸对其细胞毒性没有显著影响.结论:叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,是一种潜在的新型抗肿瘤药物.     

叶酸-阿霉素连接物的制备及其抗肿瘤活性研究

目的:合成具有酸敏特性的叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,并观察其抗肿瘤活性以及对肿瘤细胞的靶向性。方法:首先将叶酸与氨基己酸连接,然后利用腙键与阿霉素连接,采用核磁共振、质谱等方法鉴定其结构;采用MTT法观察连接物对叶酸受体表达阳性的口腔表皮样癌细胞KB细胞及叶酸受体表达阴性肺癌A549细胞的毒性作用。结果:在氮羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的催化作用下,合成了叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,波谱分析提示为目标产物。与游离阿霉素相比,连接物对KB细胞具有更强的细胞毒性,而且细胞毒性作用可被外源性叶酸抑制;而连接物对A549细胞的毒性弱于游离阿霉素,而且外源性游离叶酸对其细胞毒性没有显著影响。结论:叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,是一种潜在的新型抗肿瘤药物。     

龙须菜的药用价值及其抗肿瘤活性

大型海藻龙须菜富含活性多糖、藻红蛋白、膳食纤维和营养元素等,具有调节免疫活性、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等多种生物活性、药用价值和保健功效,经常食用可预防肥胖、高胆固醇、高血脂、便秘等代谢疾病。近年来,随着龙须菜抗肿瘤活性成分的筛选与深入分析,越来越多的人开始关注龙须菜的抗肿瘤活性及其在肿瘤防治中的作用与机理。对龙须菜药用价值及其抗肿瘤活性的新进展进行总结有利于指导抗肿瘤新药的研制和开发,从而更好地预防和治疗肿瘤。     

可溶性人TNFR75的表达、纯化及活性鉴定

将编码可溶性人TNFR75 (shTNFR75 )的cDNA与酵母整合载体pPICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞GS 115 ,获得了shTNFR75在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .甲醇诱导的pPICZαA shTNFR75 GS115重组酵母工程细胞培养上清 ,经CNBr活化的TNF Sepharose4B亲和层析柱纯化 ,纯化产物纯度为 92 % ;经Western印迹分析 ,可被TNFR75单克隆抗体特异性识别 ,分子量约为 31kD ;受体配体结合试验 ,shTNFR75纯化产物与rhTNFα和rhTNFβ的结合能力与其阳性对照基本相同 ;中和试验显示 ,该shTNFR75可完全阻断TNF对L92 9细胞的细胞毒活性 .表明酵母系统分泌表达的shTNFR75产物具有良好的结合TNF的能力 .     

Overexpression and refolding of thioredoxin/TRAIL fusion from inclusion bodies and further purification of TRAIL after cleavage by enteropeptidase

The human TRAIL gene (encoding residues 114-281) was synthesized by PCR and cloned into plasmid pET-32a. High level expression (1.5 g l(-1)) of thioredoxin/TRAIL fusion was achieved in Escherichia coli strain BL21(DE3), mainly as inclusion bodies. Refolded fusion thioredoxin/TRAIL was cleaved by enteropeptidase and TRAIL was separated from thioredoxin on Ni-NTA agarose. High yield (400 mg l(-1)) of TRAIL without N-terminal methionine and His tag was obtained. Sedimentation coefficient demonstrated that 98% of TRAIL formed trimers. TRAIL formed crystals of space group P3 (1) with unit-cell dimensions a = b = 72.5 A, c = 141.5 A. Apoptosis induced in HeLa cells by purified TRAIL was 5-fold enhanced by emetine.     

A simplified method for the efficient purification and refolding of recombinant human TRAIL

Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) belongs to the TNF cytokine superfamily that specifically induces apoptosis in a broad spectrum of human cancer cell lines but not in most healthy cells. The antitumor potential of recombinant human TRAIL (rhTRAIL) has attracted great attention among biologists and oncologists. However, attempts to express rhTRAIL in Escherichia coli often results in limited yield of bioactive protein due to the formation of inclusion bodies (IBs), which are dense insoluble particulate protein aggregates inside cells. We describe herein a highly simplified method to produce pure bioactive rhTRAIL using E. coli. The method is straightforward and requires only basic laboratory equipment, with highly efficient purification and high yield of renaturation, and may also be applied to produce other proteins that form IBs in E. coli.     

可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C600/PbvTRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白,优化发酵工艺,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略：间歇流加、Dostat、pHstat,摸索了一种流加策略,即DOstatpHstat组合流加,有效的避免了发酵过程中,尤其是诱导表达阶段乙酸积累的增加,使TRAIL蛋白在高密度培养条件下,得到高效表达。菌体密度最终达到300g/L（WCW）以上,可溶性TRAIL蛋白占菌体总蛋白的4.2%,含量为1.1g/L。在整个发酵过程中,乙酸浓度接近于0,且未使用任何特殊手段,如纯氧、加压等,简化了发酵工艺,降低了发酵成本,为TRAIL的工业化生产创造了条件。     

利用套叠PCR技术改造人可溶性TRAIL cDNA片段及真核表达载体的构建

利用套叠PCR技术对可溶性TRAIL基因片段(sTRAIL,114aa-281aa)的“KEX2”位点及“ATTTA”位点分别进行改造,并构建真核表达载体;结果表明:成功获得了3种突变基因:sTRAILK、sTRAILA以及sTRAILAK,并成功构建了4种分泌型酵母表达载体:pPICZα-A-sTRAILK,pPICZα-A-sTRAILA,pPICZα-A-sTRAILAK以及pPICZα-A-sTRAIL.     

Human mast cells express intracellular TRAIL

Recently we demonstrated that human mast cells (MC) express functional TRAIL death receptors. Here we assessed the expression of TRAIL on both mRNA and protein level in cord blood derived MC (CBMC) and HMC-1. The TRAIL release either spontaneous or induced by LPS, IFN-γ and IgE-dependent activation, was evaluated as well. The protein location was restricted to the intracellular compartment in CBMC, but not in HMC-1. The intracellular TRAIL was not localized inside the granules. The treatment with IFN-γ and LPS up-regulated intracellular TRAIL expression in CBMC, but did not induce its release. These in vitro data show that human MC can produce and express intracellular TRAIL whose location could not be altered by different stimuli.     

可溶性GST-rh TRAIL55-281最佳表达条件及凋亡活性研究

将本室构建的重组质粒pGEX-5X-TRAIL55-281转入大肠杆菌JM109和HB101中,鉴定后诱导表达,然后针对培养温度、培养时间及诱导剂IPTG浓度设立梯度试验,发现重组质粒pGEX-5X-TRAIL在JM109与HB101中的表达情况相近,可溶性的人GST-rh TRAIL55-281最佳表达条件为26℃,0.06 mmol/L IPTG,200 r/min.利用亲和层析法纯化出大量可溶性GST-rh TRAIL55-281后,通过Western Blot及流式细胞仪检测发现GST-rh TRAIL55-281有较好的免疫学活性与生物学活性.为今后TRAIL作为抗肿瘤药物的开发做必要的准备.     

TRAIL包涵体在细胞内重折叠现象的初步研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Ap02L／TRAIL）是一种新型的抗肿瘤蛋白。但在大肠杆菌表达系统中,表达的TRAIL蛋白往往容易聚集形成包涵体。本文对重组TRAIL包涵体在胞内重折叠转化成可溶性TRAIL蛋白作了初步探索,结果表明：当蛋白表达后,迅速降低温度至30℃并添加50μg／mL氯霉素继续培养4h,可溶性TRAIL产量可提高至16．7％。这一结果在3．7L罐上也得到了证实,可溶性TRAIL表达量达到14．5％。     

人TRAIL基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人TRAIL的基因组结构,生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增出人TRAIL基因编码区cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体中,序列测定表明,克隆片段与文献报道的人TRAIL基因编码区cDNA序列完全一致.     

TRAIL及其受体在细胞凋亡中的作用

ＴＲＡＩＬ是最近发现的ＴＮＦ家族的新成员。它在结构和功能方面和ＴＮＦ家族的另一成员———Ｆａｓ／ＡＰＯ １Ｌ很相似。ＴＲＡＩＬ能够诱导多种转化细胞凋亡,但对正常细胞没有这种作用。目前共发现了ＴＲＡＩＬ的５个受体。本文就ＴＲＡＩＬ及其受体的结构和功能以及可能存在的调控机制等方面进行了综述。