辣根过氧化物酶标记抗体在免疫定位上的应用 Ⅱ.肝细胞内乙型肝炎表面抗原的电子显微镜定位方法

本文介绍辣根过氧化物酶标记抗体对肝细胞内乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫电镜定位方法。电镜样品制备,可采用酶标免疫显色组织切片的再包埋、或直接利用超薄切片进行酶标免疫显色定位。对实验中应注意的一些问题进行了讨论。在电子显微镜下初步观察了HBsAg 阳性肝细胞中HBsAg 的分布和形态,并发现在光学显微镜下,辣根过氧化物酶标免疫定位HBsAg 完全为阴性部位的肝细胞中,有的细胞胞浆内或扩大的内质网池内,尚可见到少量散在的HBsAg 与酶标抗体的沉积物,提示电镜观察有更好的灵敏性。     

辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的简易方法

本文报道了HRP的二种标记抗体的简易方法。操作简便,易于掌握。可用国产酶(RZ≥2)标记。效果良好。     

辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的简易方法

本文报道了HRP的二种标记抗体的简易方法。操作简便,易于掌握。可用国产酶(RZ≥2)标记。效果良好。     

十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗16种鸟类的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为鸟类血清学检测系统的建立提供工具。方法采用水稀释法粗纯抗体后,再利用改良的饱和硫酸铵分级沉淀法,或亲和层析结合饱和硫酸铵沉淀法,或饱和硫酸铵沉淀法结合SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法进一步纯化鸟类的IgY,利用纯化的IgY免疫大耳白兔制备抗血清,用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鸟类的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鸟类的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blots考察标记抗体的特异性。结果纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的IgY,免疫双扩散法测定兔抗这16种鸟类的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗灰雁IgY、兔抗鸬鹚IgY、兔抗鸵鸟IgY、兔抗小鹈IgY、兔抗鸽子IgY、兔抗鹅IgY、兔抗孔雀IgY、兔抗鹌鹑IgY、兔抗贵妃鸡IgY、兔抗草鹭IgY、兔抗夜鹭IgY、兔抗赤嘴潜鸭IgY、兔抗燕鸥IgY、兔抗长脚鹬IgY、兔抗虎皮鹦鹉IgY、兔抗翘鼻麻鸭IgY等16种兔抗鸟类IgY的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶800～80000左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了辣根过氧化物酶标记的兔抗16种鸟类的二级抗体,为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶（2000～60000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

大鼠肝组织内甲胎蛋白的免疫酶标记定位技术

本文介绍了免疫酶标记定位技术(间接法,光学显微镜水平),并对它的优缺点、技术的几个关键及存在的问题进行了讨论。     

铁蛋白标记抗体技术及其对细胞表面抗原定位的应用

1956年Coons,A.H.建立的免疫荧光技术,对医学、生物学中抗原定位的研究是一个极有价值的工具。在类似原理的基础上,1959年Singer首先建立了马脾铁蛋白标记抗体的方法,使人们在电镜下对细胞抗原可进行精确的定位。近十几年来,利用铁蛋     

基于纳米金和辣根过氧化物酶双标记抗体的黄曲霉毒素B1高灵敏检测方法的建立及应用

黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）在自然界普遍存在,可污染多种粮食作物和饲料,给动物和人类健康造成严重威胁。为建立AFB₁高灵敏度的快速检测方法,本研究通过采用纳米金颗粒（Au nanoparticles,AuNPs）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）双标记AFB₁单克隆抗体,建立新型酶联免疫检测方法（HRP-AuNPs IC-ELISA）,检测下限（IC₁₀）为0.017ng/mL,检测区间（IC₂₀-IC₈₀）为0.026-0.376ng/mL,半数抑制率（IC₅₀）为0.099ng/mL,与黄曲霉毒素B₂、G₁、G₂ 和M₁ 的交叉反应率分别为2.7%、9.3%、2.1%和5.3%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素B₁、桔青霉素、展青霉毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。在玉米和面粉样本中的加标回收率可达88.93-103.55%,与LC-MS/MS同时对天然样本中AFB₁ 含量进行检测,结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的HRP-AuNPs IC-ELISA耗时短且灵敏度高,可用于实际样本中AFB₁ 的快速定量检测与分析,也为其他霉菌毒素的精准检测技术开发提供参考。     

辣根过氧化物酶标记DNA探针及光增强检测DNA指纹图在法医应用的研究

本文介绍了用辣根过氧化物酶直接标记DNA探针,光增强检测DNA指纹图的技术,所得图谱清晰易读,分辨率高,灵敏度为0.8μg,接近~(32)P同位素标记的水平。就150名无关个体的DNA指纹图分析表明两个个体图谱完全相同的机率是3.7×10~(-14);方法稳定性测定表明,足以取代同位素标记,用作准确的个人识别和亲子鉴定,为侦破强奸、凶杀等案件提供重要科学依据,该法简便,快速,适用于各实验室,易于推广应用。     

辣根过氧化物酶标记与样品后染色联用在微观脑联结组学中的应用

三维电子显微成像(volume electron microscopy)是微观尺度脑联结组学(micro-brain connectomics)研究的主要研究手段.自动卷带式连续超薄切片-收片系统(automated tape-collecting ultramicrotome,ATUM)及扫描电镜序列成像系统的联合应用,是三维电镜成像中一种重要的技术手段.该方法利用卷带式收集超薄切片,形成完整的样品切片库,进而在后续成像中形成样品三维电镜成像数据库.根据ATUM系统镜外切片-收片、保留样本切片库等特点,对相应的生物样品制备方法进行改进,包括树脂配方及树脂渗透方式改良,神经元细胞膜辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)稀疏化标记与样本切片库后染色联用——从而很大程度上减少样品切片的褶皱率,并使得在整体高衬度的样品图像库中高效地识别神经元身份成为可能,最终获得符合脑联结组学所需的高质量成像数据.     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大     

肌原纤维上蛋白质定位问题的研究 Ⅰ.标记抗体的电子显微镜观察在副肌球蛋白定位问题上的初步应用

(一)应用铁蛋白标记抗体的技术对尖蚌闭壳肌白色部分的粗丝作了副肌球蛋白的定位研究。结果支持了许多作者根据小角度X-光衍射和电子显微镜分别从副肌球蛋白肌丝和晶体反映出来的共同特征周期所作的推测,即副肌球蛋白是粗丝的组成部分。从免疫化学反应的结果来看,副肌球蛋白分布于粗丝的表面。(二)粗丝与标记的副肌球蛋白抗体反应后,再经反染,周期为360A的横纹结构更为清晰。此数值恰为一般在副肌球蛋白天然及人工纤维和晶体中所见到的720A周期的一半。这个观察和平行的物化研究以及对副肌球蛋白分子的电子显微镜观察,都证明副肌球蛋白可能具有亚基结构,亚基的长度为360A。(三)观察到粗丝在与标记抗体反应后,有侧向偶联现象。     

脊髓组织内微血管过氧化物酶组织化学染色方法的实验研究

本文以正常及损伤脊髓组织为材料,对内源性过氧化物酶染色显示微血管的方法进行了实验研究。结果,组织用10％缓冲福尔马林4℃固定6—12小时,或微波固定40～120秒,冰冻切片30～50μm、DAB-NiCl显示血管最好。该方法不用灌注,对血管无扩张、破裂作用,无人为改变,可以定量或半定量判定组织器官活体时的血液循环,可用于正常及损伤脊髓组织内微血管形态学研究和定量分析。     

过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法

本文研究了过碘酸钠氧化HRP的某些条件。戊二醛和磷酸盐对酶有一定的影响,而低浓度甲醛和醋酸盐缓冲液(HAcB)则无明显影响。氧化的最适pH在5.6左右。过碘酸钠氧化酶的适宜浓度在0.06～0.015M之间。氧化时间为10～30分钟,过长则影响结合物效价。讨论了加入乙二醇的必要性。醛化的HRP在pH9左右与抗体结合作用的适宜时间为16～24小时,过长则影响酶与抗体的活性,过短则结合不够完全。封闭结合物上多余醛基的KBH_4适宜量为0.1～0.2mg/mg酶。本法标记抗体、抗原和葡萄球菌A蛋白的效果均较好,方法简易,标记效果取决于酶是否能与抗体和抗原相结合,以及标记过程中酶和抗体活性是否受影响。     

免疫酶定位技术Ⅱ.固定剂的选择和反应的专一性——人体肝组织内甲种胎儿蛋白的定位

本文着重讨论免疫酶定位工作中组织固定剂的选择和酶标反应专一性等问题。以苦味酸-甲醛固定液应用于肝组织内甲种胎儿蛋白(简称甲胎蛋白)的定位获得满意结果。以事先筛选待免疫的动物排除非特异反应,通过一系列对照实验证明反应的专一性。在过去几年中我们曾建立了免疫酶定位技术,并应用于系统观察大鼠肝组织内甲胎蛋白的分布情况及其与细胞分裂、分化和癌变的关系,其后又应用这一技术于人体肝组织的甲胎蛋白的定位。本文报道在前阶段工作基础上,进一步比较了几种固定剂应用于人肝脏甲胎蛋白定位的效果,同时为了排除未经免疫的兔血清(正常兔血清)与人肝组织产生非特异阳性反应。采用事先筛选兔子的方法以排除非特异反应的干扰,最后再经过比较系统的对照实验以证明反应的专一性。     

玉米组织同工酶和蛋白质谱带的遗传研究——Ⅰ.过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶酶谱

本研究共采用110份玉米材料,应用垂直或卧式平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和双波长色谱扫描仪扫描方法,对28种组织的过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶作了组织特异性的鉴定和遗传分析。结果表明,两种酶的第4、5酶带是检验美、亚洲(中国)两大起源地区玉米亲缘关系的标记酶带,这两条酶带又主要是玉米绿色组织(包括绿色叶片、叶鞘、苞叶和幼芽等)所特有的酶带;两种酶的第4、5酶带都是受1对共显性等位基因所控制。试验结果有助于进一步研究标记酶带,为标记酶带结构基因的定位打下基础。     

水稻磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶在蛋白质水平上的组织和诱导表达特征

蛋白质是生命活动的主要承担分子,了解蛋白质在有机体中的时空分布对于正确解析蛋白质的功能十分重要．磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (PHGPx) 是目前发现的唯一能够直接还原膜上脂类过氧化物的抗氧化酶,在保护生物膜免受过氧化损伤方面有着重要作用．采用Western blot技术,分析了水稻PHGPx (OsPHGPx) 在水稻不同组织以及多种胁迫条件下的蛋白质表达特征．结果表明,OsPHGPx在成熟水稻植株内主要分布于叶组织中,以旗叶中含量最高,而在水稻幼苗中则在茎及叶组织中均检测到较强的杂交信号．OsPHGPx在幼苗中的表达受到H₂O₂和NaCl的强烈诱导,但植物激素对其表达的影响较弱．H₂O₂和NaCl的诱导效果呈现出时间及剂量的相关性,当用0.5 mmol/L H₂O₂处理12 h或用500 mmol/L NaCl处理24 h,此时OsPHGPx表达量达到最大值．对H₂O₂清除剂二甲基硫脲处理的水稻幼苗,外源H₂O₂的再处理并不能诱导OsPHGPx的表达,而NaCl的诱导效果并不受影响,说明H₂O₂可能并不介导NaCl诱导OsPHGPx的表达．这些结果为进一步研究OsPHGPx在水稻中生物学功能奠定了基础．     

数学形态学在昆虫分类学上的应用研究.Ⅰ.在目级阶元上的应用研究

根据昆虫图像,对半翅目（Hemiptera）、鳞翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）的34种昆虫提取形状参数、叶状性、球状性等7项数学形态特征进行了统计分析,从而论证了各项数学形态特征在目级昆虫分类阶元上作为分类特征的可行性和可靠性,并从数学形态学角度对所涉及到的同阶元昆虫类群的亲缘关系做了描述。结果表明,在作为目级阶元分类特征时,各项特征的可靠性依次为：(似圆度、偏心率、亮斑数)＞(叶状性、球状性、圆形性)＞形状参数。由这些特征的差异显著性可知,从数学形态特征角度讲,3个目的亲缘关系远近大小依次为：半翅目与鞘翅目＞半翅目与鳞翅目＞鳞翅目与鞘翅目。     

数学形态学在昆虫分类学上的应用研究.Ⅰ.在目级阶元上的应用研究

根据昆虫图像,对半翅目（Hemiptera）、鳞翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）的34种昆虫提取形状参数、叶状性、球状性等7项数学形态特征进行了统计分析,从而论证了各项数学形态特征在目级昆虫分类阶元上作为分类特征的可行性和可靠性,并从数学形态学角度对所涉及到的同阶元昆虫类群的亲缘关系做了描述。结果表明,在作为目级阶元分类特征时,各项特征的可靠性依次为：(似圆度、偏心率、亮斑数)＞(叶状性、球状性、圆形性)＞形状参数。由这些特征的差异显著性可知,从数学形态特征角度讲,3个目的亲缘关系远近大小依次为：半翅目与鞘翅目＞半翅目与鳞翅目＞鳞翅目与鞘翅目。