乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14)-14-2)在豚鼠体内保护作用的免疫机制的研究

本实验将乙脑减毒活疫苗ＳＡ_（１４）－１４－２株以不同疫苗病毒量（３．８７ＰＦＵ／ｍｌ和５．８７ＰＦＵ／ｍｌ）分别一次免疫豚鼠,观察其对强毒攻击后抑制毒血症和抗体形成的能力。结果显示疫苗（５．８７ＰＦＵ／ｍｌ）免疫组豚鼠攻击前虽然中和抗体阴性或很低,但经攻击感染后不同时间内均未出现病毒血症,对照组豚鼠则于第２,３,４天全部出现病毒血症。表明一次活疫苗免疫后能有效地抑制病毒血症的产生。免疫后３０天虽然免疫组的豚鼠中和抗体很低,但攻击感染后抗体迅速增长。第四天的抗体滴度为１：８～３２,第５天达１：１２８～２５６,第１４天抗体高达１：５１２～１０２４;而对照组抗体则上升很慢,第７天才出现低水平抗体（１：４）。血凝抑制抗体增长的动态与中和抗体近似。表明活疫苗免疫后虽然中和抗体水平不高,但一经感染可迅速产生高滴度抗体达到保护作用。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性研究

目的 评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性。方法 制备含MF59佐剂的H7N9禽流感病毒裂解疫苗成品,放置于(6±2)℃环境下,取保存6、24和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,以血凝抑制效价和微量中和抗体滴度来评估该疫苗的免疫原性。同时,用存放30个月的疫苗进行2次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。结果 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(6±2)℃保存30个月后免疫小鼠,检测其血凝抑制抗体效价和微量中和抗体滴度均没有明显的变化,且免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的免疫原性,在(6±2)℃至少可保存30个月。     

柯萨奇病毒A组16型灭活抗原对小鼠免疫保护作用的研究

为了研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)灭活抗原在小鼠体内所产生免疫保护作用效果,我们选用CVA16临床分离株521-01T,在Vero细胞中进行大量培养,并对培养产物进行甲醛灭活及超速离心纯化。SDS-PAGE和Western blot对纯化的灭活病毒纯度及性质进行初步分析。Al(OH)3+CVA16及单独CVA16抗原,分别经皮下注射免疫雌性ICR小鼠;相同免疫途径、剂量于第14和28d加强免疫2次。ELISA法检测CVA16特异性血清IgG抗体滴度;微量中和试验法鉴定血清中和抗体滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化。对Al(OH)3+CVA16抗原免疫组母鼠所产仔鼠进行脑腔攻毒,检测母传抗体对新生乳鼠的保护作用。结果显示,Al(OH)3+CVA16灭活抗原在小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,3次免疫后产生的特异性血清IgG抗体滴度最高可达1∶1×105(P=0.000),中和滴度高于1∶256。同时,该抗原还可以诱导特异性T淋巴细胞的活化。以1 000LD50的病毒量脑腔接种48h内新生乳鼠的病毒攻击实验显示,该母传抗体对新生乳鼠具有100%的保护。这一结果表明该灭活CVA16病毒抗原具有较好的免疫原性及保护性,为CVA16灭活疫苗的研究及评价体系提供了参考。     

中国婴儿中脊灰母传抗体水平对两种疫苗免疫效果的影响

为了了解2月龄婴儿中针对脊髓灰质炎病毒的中和抗体水平,并探讨母传抗体对脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)免疫效果的影响。对416名2月龄婴儿分别接种OPV和IPV,采集免疫前后血清,用微量中和法检测血清中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,评价抗体GMT水平及4倍增长情况。检测结果显示,2月龄婴儿母传抗体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型阳性率分别为45%、38.2%和17.5%,抗体GMT水平为9.0、8.1和5.2。经接种两组疫苗后,母传抗体阳性者与阴性者免后抗体GMT水平相比,OPV组无明显差异,IPV组阳性者略低于阴性者。在免前抗体滴度<1∶32人群中,OPV组免后抗体滴度4倍增长率及几何滴度增长倍数分别为:Ⅰ型93.6%、71.2;Ⅱ型98.2%、43.7;Ⅲ型91.7%、47.9;IPV组免后抗体滴度4倍增长率及几何滴度增长倍数分别为:Ⅰ型82%、9.4;Ⅱ型62.8%、5.1;Ⅲ型95.6%、11.7;在免前抗体滴度1∶32～1∶128人群中,OPV组Ⅰ型92.3%、23;Ⅱ型86.4%、13.9;Ⅲ型55.6%、4.1;IPV组Ⅰ型48%、2.5;Ⅱ型15%、0.9;Ⅲ型55.6%、2.7。目前中国2月龄婴儿免前脊灰抗体阳性率较高,尤其是Ⅰ、Ⅱ型。脊灰母传抗体对两种疫苗免疫效果有一定干扰,对IPV疫苗的影响较为明显。     

表达乙型脑炎病毒抗原的非复制型重组痘苗病毒能在小鼠中诱发免疫保护

使用2×107PFU乙脑病毒野毒株GSS抗原preM-E-NS1-NS2a的非复制型重组痘苗病毒NTV-JEV免疫3周龄BALB/c小鼠,小鼠体内乙脑病毒特异性抗体滴度1∶71,IgG2a/IgG1为1.5,中和抗体滴度为1∶8,免疫组小鼠产生特异性补体介导的细胞杀伤作用。以10 LD50乙脑P3株病毒对小鼠进行了脑内攻击,NTV-JEV免疫组小鼠存活率为100%,与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2免疫组存活率相同。100 LD50P3株病毒攻击后NTV-JEV免疫组存活率28.6%,与SA14-14-2组免疫效果无明显差别。存活小鼠体内乙脑病毒特异性抗体升高为1∶179,IgG2a/IgG1比值为1.9,中和抗体大于1∶16。以30 LD50GSS株病毒进行攻击后,NTV-JEV免疫组和SA14-14-2组保护率均为8.3%。上述结果表明,NTV-JEV与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株具有相近的保护力,NTV-JEV不仅可以保护小鼠抵抗同株病毒GSS的攻击,而且可以抵抗异株病毒P3的攻击。     

限量抗原底物珠体系固相酶免疫分析法用于抗腺病毒的IgG抗体的检测

1978年冬至1979年春我们用固相酶免疫分析法中的限量抗原底物珠体系(Dass)间接法检测临床诊断为病毒性肺炎及麻疹合并病毒性肺炎患儿的9 l例双份血清中的抗3和7型腺病毒的0gG抗体,同时以微量血凝抑制试验进行对照,其符合率为90．5％。同时期对临床诊断为非腺病毒感染的lo例双份血清进行检测,两种方法滴度均无四倍升高。非腺病毒感染息者DAssIgG抗体水平较有近期感染患者为低,前者1：64,后者1：2,048。对抗3和7型腺病毒的兔免疫血清及正常兔血清Dass法测定结果及抑制与阻断实验均说明本方法是特异的,其灵敏度较血凝抑制试验高约50倍左右。     

血凝抑制和病毒中和法在大流行流感疫苗临床血清学评价中的应用和比较

在大流行流感疫苗临床试验的免疫效果评价中,分别采用血凝抑制(HI)和病毒中和(VN)法检测血清中抗体滴度,并对结果进行比较。在中和试验中,分别以观察细胞病变法和血球凝集法确定中和法终点,两种方法得到的结果相近。376份血清(63.4%)以VN法和HI法检测获得结果相同。经统计学分析证明两种方法有很好的相关性,r值为0.85,HI 1∶40对应的VN滴度为1∶33。因此,在大流行流感疫苗免疫效果评价中,两种抗体检测方法有较好的一致性。     

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。     

中国HIV-1 B亚型P55和嵌合的P55-V3病毒样颗粒候选疫苗免疫效果的研究

研究我国艾滋病病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）病毒样颗粒（ＶＬＰ）候选疫苗的免疫原性,为疫苗进行灵长类实验提供实验依据。将ｇａｇ和ｇａｇ－Ｖ３ ＶＬＰ不同剂量（５０μｇ、１０μｇ、１μｇ）在有佐剂（氢氧化铝）和无佐剂条件下皮下免疫小鼠,然后眼眶采血,用ＥＬＩＳＡ法观察免疫鼠血清中抗体与剂量关系,以及中和抗体滴度和抗体ＩｇＧ亚型ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平。同时取鼠脾淋巴细胞,体外抗原刺激后收取淋巴细胞分泌上清     

人乳头瘤病毒6/11型L2片段的高效表达及免疫效果评价

目的:原核表达人乳头瘤病毒(HPV)6型和11型L2 N端融合蛋白,并初步评价其免疫效果。方法:用重叠PCR将HPV6和HPV11次要衣壳蛋白L2基因5'端片段融合,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化后与Al(OH)3佐剂配伍肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测血清抗体,以基于假病毒的体外中和试验评价中和抗体水平。结果:ELISA结果显示,3种融合蛋白均能产生针对同型别L2蛋白的高滴度特异性Ig G抗体,滴度为1∶10 000~1∶200 000;体外中和试验显示,3种融合蛋白均能诱发中和抗体和交叉中和抗体,针对同型别的滴度最高可达1∶3200,对于高危型能产生一定水平的交叉中和抗体,滴度为1∶50~1∶800。结论:HPV6/11 L2融合蛋白能够诱发较强的体液免疫反应,产生较高的中和抗体及交叉中和抗体,为HPV L2新型预防性疫苗的研究提供了初步的实验基础。     

柯萨奇病毒A组4型生物化学特性及免疫原性分析

对引起手足口病的肠道病毒A组4型进行生物化学特性及免疫原性的研究。利用大肠杆菌表达结构蛋白全长或部分片段的GST融合蛋白,纯化CV-A4病毒颗粒,制备兔抗CV-A4 VP1～VP4蛋白及抗CV-A4病毒颗粒抗血清。以免疫印迹法（Western blotting,WB）,结合SDS-PAGE电泳法,对CsCl密度梯度纯化的CV-A4的空心颗粒（EP）与实心颗粒（FP）的蛋白组分、纯度、多聚蛋白酶剪切进行分析。以微量中和法测定以上6种抗原免疫的兔或小鼠血清中和抗体效价,评估免疫原性。WB和间接免疫荧光法证明了抗体特异性。EP由VP0、VP1和VP3构成,而FP的VP0被剪切,故由VP1-VP4构成。EP和FP比例分别为41%和59%。CsCl密度分别为1.26 g/cm3和1.34 g/cm3,纯度分别为70.5%和96.3%。中和试验显示,兔抗全病毒抗体具有中和作用,而兔抗CV-A4VP1～VP4结构蛋白抗体不具有中和作用。免疫原性强弱为：FP>EP>VP1-VP4。本研究建立了CV-A4纯化病毒结构蛋白的分析方法,研究了重组病毒蛋白及2种病毒颗粒的免疫原性及免疫持久性。对包...     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

含甲肝病毒基因的重组痘苗病毒在动物体内产生针对甲肝病毒的中和抗体

用DNA重组技术得到的含甲肝病毒基因的重组痘苗病毒,可在家兔体内产生ELISA竞争抑制与中和抗体。基础免疫后,动物体内竞争抑制抗体滴度为10,加强免疫后达到80。由重组病毒产生的抗体中和指数比甲肝病毒产生者略低。     

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2多肽对恒河猴的免疫保护研究

在大肠杆菌中表达的一段戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白NE2,纯化后以弗氏佐剂,按0d,10d,30d的方案10μg/针的剂量免疫3只恒河猴,在第2周抗体阳转,第6周时1只滴度达1∶100 000,另2只滴度1∶20 000,此时以106 PCR滴度的HEV病毒粪悬液攻击。对照组3只均出现血清转氨酶（ALT）升高,抗体阳转,粪便持续排毒1月以上;疫苗组无一发病,未检出非疫苗来源的抗体,其中1只始终未检出粪便排毒,另2只仅出现短暂排毒。以一份NE2免疫后猴血清（滴度1∶20 000）与103 PCR滴度的病毒混匀后感染2只恒河猴,结果对照组2只均持续排毒3周以上,抗体阳转,1只ALT明显升高;而抗体中和组2只猴始终未检出粪便排毒,抗NE2抗体缓慢下降,ALT正常。这些结果表明NE2具有良好的免疫原性和免疫保护性,有可能成为有效的戊肝疫苗。     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体

为研究重组病毒样颗粒（virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型（human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP的HPV－6L1＋L2 VLP免疫BALB／c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用。VLP诱导了高滴度（＞1：10000）的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮细胞的感染。重组HPV－6VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用。提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗。     

肾综合征出血热Vero细胞疫苗毒种的选育及生物学特性研究

在肾综合征出血热(HFRS)疫苗Vero细胞毒种研制中,将肾综合征出血热(HFRS)病毒PS-6(Ⅰ型)、L99(Ⅱ型)在Vero细胞上连续传代,并对其病毒滴度、免疫原性、传代稳定性等进行检测。结果显示,两株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8.5 lgCCID50/m l,免疫原性检查,将病毒灭活制成疫苗免疫家兔的血清中和抗体效价>1:10,其他检测符合规程要求。因此,适应的PS-6(Ⅰ型)和L99(Ⅱ型)毒种可用于制备Vero细胞出血热疫苗。     

小鼠对重组痘苗病毒表达流感病毒血凝素的免疫反应

实验比较了小鼠对表达流感病毒A/NJ/11/76(H1N1)和A/Jap/305/57(H2N2)血凝素基因的痘苗病毒重组株HSW2和VInf1的免疫反应,两株重组病毒经静脉或静脉加鼻腔免疫小鼠后都产生相应血凝抑制抗体;用不同剂量的痘苗病毒重组株HSW2皮内接种家兔也产生相应抗体,且抗体滴度与接种的病毒量成正比关系,但用痘苗病毒野毒株免疫的家兔未测到抗体,这两株痘苗病毒重组株免疫的小鼠,能保护小鼠对流感病毒母株的攻击,HSW2和VInf1的保护指数分别为3.3和3.9个对数,但这两株病毒未能诱导细胞毒性T细胞反应。     

H7N9灭活疫苗联合MF59佐剂在小鼠体内诱导的长效体液免疫应答

以BALB/c小鼠为模型,探讨H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠后所诱导的长效体液免疫应答的动态变化。不同剂量的流感H7N9全病毒灭活疫苗单独或辅以MF59佐剂肌肉注射免疫小鼠一次。连续采集免疫后小鼠15个月的血清,用ELISA方法检测特异性IgG抗体水平,血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和微量中和(microneutralization,MN)试验检测第15个月时的HI抗体和中和抗体效价。实验结果发现,小鼠血清中的特异性IgG抗体水平随时间变化持续缓慢上升,第5个月时达到顶峰,随后略有下降但一直持续平稳状态;IgG抗体滴度与疫苗剂量成正相关,且添加佐剂能提高抗体滴度。HI及MN抗体检测表明,免疫后第15个月产生的抗体能有效中和病毒,且抗体跟疫苗剂量成正比。以上研究表明,H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠一次诱导产生的特异性抗体能在较长期内保持比较平稳的抗体滴度,为小鼠提供免疫保护;增加抗原剂量和添加MF59佐剂能增加疫苗特异性抗体水平。该研究为H7N9流感疫苗产生的长期保护效应提供了一定的数据积累和参考。     

基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性比较

为了筛选出免疫原性最佳的基因Ⅰ型乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原,将基因Ⅰ型JEVGS株的prMEIII融合基因、polytope复合表位基因和prMEIII-polytope融合基因分别克隆构建到原核表达载体pET-30a上,经诱导表达纯化获得重组蛋白。将制备的重组蛋白免疫小鼠,通过ELISA监测体液免疫反应、通过噬斑减少中和试验滴定中和抗体滴度、通过细胞因子表达丰度和淋巴细胞增殖实验分析细胞介导的免疫反应,比较分析制备的乙型脑炎病毒亚单位疫苗候选抗原的免疫原性。结果表明:获得的分子量分别为35kDa(prMEIII)、28kDa(polytope复合表位抗原)和57 kDa (prMEIII-polytope)的重组蛋白均能诱导免疫小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。与prMEIII-polytope和polytope重组蛋白免疫组相比,prMEIII蛋白可诱导免疫小鼠产生更高的IL-2和IFN-γ表达丰度和淋巴细胞增殖水平(P0.05)。prMEIII蛋白免疫小鼠诱导产生的中和抗体滴度接近于商品化乙脑减毒疫苗SA14-14-2 (P0.05)。上述研究结果表明,prMEIII重组蛋白可以作为乙型脑炎病毒亚单位疫苗的备选蛋白。