槲皮素-3-O-乙酸酯、槲皮素-3-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性

为改善槲皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以芦丁为原料,经"3'、4'、7位羟基苄基化-酸水解苷键-3位羟基酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出槲皮素-3-O-乙酸酯和槲皮素-3-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为243.27μg/m L和8.13μg/m L,均高于槲皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,体外IC50分别为94.1μmol/L和204.9μmol/L,均低于槲皮素值,体内抑聚率均高于槲皮素。实验结果表明,通过选择性酰化槲皮素的3位羟基,引入含2个或3个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性

为改善柚皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以柚皮苷为原料,经"4'位羟基苄基化-酸水解苷键-酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为637.34±53.23μg/m L和59.74±4.81μg/m L,均高于柚皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,且抑聚率均高于柚皮素。实验结果表明,通过选择酰化柚皮素的7位羟基,引入含1~2个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

具有抗血小板聚集功能的新型葡激酶突变体的表达、纯化及性质

[目的]为解决溶栓后再栓塞问题,构建N-端含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的葡激酶双功能突变体.研究突变体的表达和纯化,并进行性质分析.[方法]将突变后的葡激酶突变体序列连入pBV220质粒,转化大肠杆菌BL21进行表达.阳离子交换、凝胶过滤和阴离子交换三步层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定,并测定纯化产物对血小板聚集的抑制效应.[结果]PAGE扫描结果显示,葡激酶突变体蛋白在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体蛋白总量的40%～50%;三步层析纯化后,HPLC测定其纯度可达95%.酪蛋白凝胶板溶圈法测得其比活性分别为10.8×104和11.0×104HU/mg,与野生型葡激酶活性相当;且具有明显的抗血小板聚集活性,血小板聚集仪测定其血小板聚集抑制率分别为10.72%和19.71%,明显高于野生型葡激酶血小板聚集抑制率.本实验利用pBV220载体高效表达了葡激酶突变体基因,得到了高纯度、高活性的突变体蛋白,为葡激酶生产产业化和临床应用奠定了良好的基础.     

天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究

为探讨天麻成分对羟基苯甲醛的抗血小板聚集作用,本实验以二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、血小板活化因子(PAF)为诱导剂,探讨了对羟基苯甲醛的体外抗血小板聚集活性;采用ADP静脉注射致小鼠肺栓塞方法以及下腔静脉结扎致大鼠静脉血栓方法,考察了对羟基苯甲醛的体内抗血小板聚集活性;并对经口给药的对羟基苯甲醛的急性毒性进行了检测。结果表明,天麻成分对羟基苯甲醛对ADP诱导的家兔体外血小板聚集有明显的对抗作用,其半数抑制率(50%inhibitory concentration,IC50)为2mmol/L,对PAF诱导的家兔体外血小板聚集无明显影响;天麻成分对羟基苯甲醛能明显降低小鼠肺栓塞死亡率,并显著对抗大鼠下腔静脉血栓的形成。说明天麻成分对羟基苯甲醛在体外、体内均具有显著的抗血小板聚集活性。急性毒性研究结果表明天麻成分对羟基苯甲醛经口给药的小鼠半数致死量(lethal dose 50,LD50)为1.23 g/kg。     

紫锥菊提取物及酚酸化合物体外抗血小板聚集活性研究

为探究紫锥菊提取物及酚酸化合物体外抗血小板聚集活性,体外抗血小板聚集实验采用Born比浊法,以聚集抑制率和半数抑制浓度为指标评价。同时采用分子对接方法,选择凝血因子V(F5)、凝血因子VIII(F8)及凝血因子XI(F11)与酚酸类化合物进行虚拟对接,研究其抗血小板聚集的分子作用靶点。结果表明化合物S-1～S-10及其提取物对体外ADP诱导的血小板聚集有抑制作用,抑制率呈浓度依赖性,S-6与靶点的结合位点更多,选择性更强。紫锥菊中酚酸类化合物及其提取物在体外均显现出抗ADP诱导的血小板聚集活性,为紫锥菊体内研究提供依据。     

尖吻蝮蛇毒活性肽K组分对血小板聚集和超微结构的影响

目的应用电镜研究尖吻蝮蛇毒活性肽(K组分)对血小板聚集和超微结构的影响,以探讨其抗血小板聚集的机制。方法取2周内未服任何药物健康志愿者静脉血,观察K组分对二磷酸腺苷(ADP)和胶原(collagen)诱导的血小板聚集作用的影响。将已调好的PRP分为5组,A组为空白对照组,B、D组为加入等体积的生理盐水组,C、E组为加K组分组。B、C组分别加血小板聚集诱导剂ADP,D、E组分别加血小板聚集诱导剂胶原,各组分别制成超薄切片样品进行电镜观察、摄片,测出其聚集抑制率。结果K组分能抑制由ADP和胶原诱导的血小板聚集,剂量与抑制率成量效关系,IC50经直线回归分别为0.067和0.088μmol/L。ADP和胶原组血小板形态不规则,突起明显增多。K组分组血小板形态基本规则,膜表面清晰光滑,颗粒较ADP与胶原组明显增加,胞浆空泡化现象减轻。结论K组分明显抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集反应及其超微结构的改变。     

SA-hirudin-RGD融合蛋白的原核表达及其抗凝血酶与抗血小板聚集功能的研究

目的:构建SA-hirudin-RGD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其抗凝血酶、抗血小板聚集功能进行初步验证。方法:利用基因重组技术将链霉亲和素(SA)核心区与hirudin-RGD序列连接,并克隆到原核表达载体PET-44b中,Westernblotting鉴定经IPTG诱导后纯化的融合蛋白。抗凝血酶和抗血小板聚集作用分析证明该融合蛋白既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结果:重组载体p ET44b-SA-hirudin-RGD经限制性酶切鉴定和基因测序证实构建成功;经IPTG诱导后SA-hirudin-RGD融合蛋白在大肠杆菌中高效表达;纯化得到该目的蛋白,相对分子质量经Westernblotting鉴定约为70000。抗凝血酶和抗血小板聚集的实验证明,融合蛋白SA-hirudin-RGD既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结论:具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能的SA-hirudin-RGD融合蛋白被成功表达和纯化,为下一步SA-hirudin-RGD的功能研究及临床应用确立了基础。     

短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用

目的研究短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其抗血小板聚集作用。方法磷脂酶A2的分离纯化采用CM-SephadexC-25、DEAE-SepharoseCL-6B、SephacrylS-200、SephadexG-75柱层析法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白分子质量,以磷脂酶Az测定方法测定其酶活性,用比浊法测定其对二磷酸腺苷（ADP）引起的血小板聚集的影响。结果从短尾蝮蛇毒中纯化所得磷脂酶A2的相对分子质量为16．0×10^3（非还原）、17．6×10^3（还原）,它具有磷脂酶A2活性,能明显抑制ADP引起的血小板聚集并呈剂量-效应关系。结论此方法成功地从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂酶A2,并能抑制血小板聚集。     

王不留行中刺桐碱的分离鉴定及抗炎活性研究北大核心CSCD

利用有机溶剂萃取、制备型薄层层析、半制备高效液相色谱三步分离法从王不留行中分离出生物碱物质,鉴定并探讨其抗炎活性。王不留行种子经石油醚脱脂、乙醇回流提取,二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取,获得水饱和正丁醇相(组分A3)。组分A3经制备型薄层层析分离,展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5,上层),于紫外灯254 nm、365 nm下检视,分为7个组分(组分B1~B7)。含量高且峰形简单的组分B2经半制备高效液相色谱分离,甲醇-水作为流动相,获得1个单体化合物(样品I)。经HPLC分析,样品I纯度高于98%。通过化学反应、UV、IR、LC-MS、1H NMR、13C NMR多种波谱分析方法对该化合物进行结构解析,确定其分子式为C14H18N2O2,化学名称为N,N,N-三甲基色氨酸,中文名为刺桐碱(hypaphorine),属于吲哚类生物碱。再采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀的炎症模型,观察刺桐碱的抗炎效果。连续给药6 d后,刺桐碱剂量为25 mg·kg-1时,可显著抑制小鼠耳廓肿胀,肿胀抑制率为52.02%。与阿司匹林(200 mg·kg-1)的肿胀抑制率(67.48%)相比,无显著性差异。本研究首次采用一条新工艺路线获得王不留行刺桐碱,并发现其在整体水平上具有抗炎活性,有望成为化学一类新药的候选分子。     

花旗松素衍生物的设计、合成及抗炎活性构效关系研究北大核心CSCD

以邻羟基苯乙酮衍生物和苯甲醛衍生物为原料,经缩合、氧化、水解生成A环和/或B环取代的花旗松素衍生物4a^4o。以邻氨基苯乙酮衍生物和苯甲醛衍生物为原料,经同样的方法得到C环改变的花旗松素衍生物4p^4r。共设计合成19个化合物,其结构经核磁共振氢谱、碳谱分析确证。测定所合成化合物对小鼠巨噬细胞RAW264. 7的体外抗炎活性。结果表明:A环上的5,7位酚羟基是其发挥活性的关键性基团; B环4/位的卤素取代基对于活性影响极大,特别是氟原子的取代效果尤其显著;改变C环的结构都会使其炎症因子的抑制作用降低。     

含RGD模体的人白细胞介素18(IL-18)突变体的酵母表达及其抗血小板聚集活性

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达.用SephadexG100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白.对该蛋白进行了血小板聚集抑制实验和对GPⅡbⅢa与Fn结合的抑制实验.含RGD模体的重组IL18(IL18RGD)显示了较强的体外抑制血小板聚集活性,IC50=8.8μmolL;并具有与GPⅡbⅢa的竞争结合活性,IC50=8.0μmolL.该含有RGD模体的重组IL18仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力.结果表明,此IL18RGD嵌合体在具有抗炎,抗感染的同时增添了新的抑制血小板聚集功能.     

烟草内生真菌及其提取物的抗细菌活性(英文)北大核心CSCD

从健康烟草的根和茎中分离到38株内生真菌,对23株代表性内生真菌菌株进行了形态观察和ITS-r DNA分析,共鉴定出18个属,其中Acremonium(菌株Nitaf01和Nitaf02)、Fusarium(菌株Nitaf07、Nitaf08和Nitaf09)、Penicillium(菌株Nitaf18和Nitaf20)和Plectosphaerella(菌株Nitaf11和Nitaf12)为主要属,有13个属(Acremonium、Cladosporium、Clonostachys、Ilyonectria、Mortierella、Myriodontium、Petriella、Plectosphaerella、Podospora、Purpureocillium、Rhizopycnis、Stephanonectria和Thielavia)的真菌为首次从烟草中分离得到。5株内生真菌(Colletotrichum sp.Nitaf05、Fusarium sp.Nitaf07、Purpureocillium sp.Nitaf13、Penicillium sp.Nitaf20和Rhizopycnis sp.Nitaf22)的菌丝和发酵液提取物均表现出较强的抗细菌活性。结果表明烟草存在丰富的内生真菌,这些内生真菌具有生产抗菌活性成分和作为生防菌剂应用的潜力。     

四种中药单体选择性抑制环氧合酶-2活性的评价北大核心CSCD

为研究COX-2与中药抗肿瘤多药耐药的相关性,通过体外酶反应筛选实验,测定姜黄素、青藤碱、牡荆素、芹菜素对环氧合酶-1(COX-1)、环氧合酶-2(COX-2)的活性抑制作用,使用选择性指数(COX-1的IC50/COX-2的IC50)评价其COX-2活性的选择性,该实验结果显示:这四种物质对COX-2选择性指数依次为:牡荆素128. 71、姜黄素16. 24、芹菜素8. 45、青藤碱3. 55。并首次用分子对接相关数据中对接分子的对接内能及其与分子酶结合能差异性大小比较,评价了这四种物质对COX-2选择性活性,所得分子选择性结果与体外酶反应实验结果相吻合。从抑制活性和对COX-2选择性指数综合评价,牡荆素为较优化合物,可作为新的对COX-2有更高选择性活性的先导化合物。     

应用血栓弹力图评价替罗非班对行急诊介入的ACS患者血小板聚集功能及活性的影响

目的:应用血栓弹力图评估(TEG)替罗非班对急性冠脉综合症(ACS)患者血小板聚集功能及活性情况,探讨对于ACS患者行急诊介入时,早期应用替罗非班对介入治疗效果的影响.方法:入选100例拟行急诊介入治疗的ACS患者,于冠状动脉造影前随机分为干预组(在3分钟内推注替罗非班组10 μg/kg,以0.15 μg/kg/min速度静脉维持泵入36小时,共50例)和对照组(不应用替罗非班,共50例),分别于入选后即刻、替罗非班应用后24小时、停用后24小时抽血,采用血栓弹力图记录血小板聚集功能的抑制率(IPA)及活性.结果:两组之间的入选后即刻IPA差异无统计学意义(P＞0.05),替罗非班应用后24小时血小板聚集抑制水平达到高峰,IPA为(92.6±8.6)％,显著高于对照组[(33.3±9.8)％,P＜0.01],停用替罗非班后24小时,两组之间的IPA差异无统计学意义(P＞0.05).替罗非班应用24小时后,血小板活性显著低于对照组[(46.7+ 10.2) mm比(59.7+ 7.8) mm,P＜0.01].结论:TEG能动态监测凝血功能全过程,全面评估血小板功能及凝血情况,指导ACS患者抗血小板药物方案选择.在进行介入治疗的ACS患者中早期应用替罗非班较常规口服药物能更好地达到血小板聚集抑制作用,可以获得更好的即刻造影结果,减少术后缺血性事件发生,提高临床顸后情况.     

Ad-ERα-36-Fc-GFP的制备及鉴定北大核心CSCD

ERα-36是雌激素受体α新亚型,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药,可作为治疗靶点,但目前仅有小分子靶向药物研发。利用重组腺病毒携带诱饵受体,可进行靶向ERα-36的基因治疗探索。首先通过基因工程技术,构建可表达由Igκ信号肽引导分泌的重组融合蛋白ERα-36-Fc的穿梭质粒pDC316-Igκ-ERα-36-Fc-GFP;利用AdMax;腺病毒包装系统进行Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的包装、鉴定及扩增;感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231并进行表达及功能验证。结果表明成功制备Ad-ERα-36-Fc-GFP重组腺病毒,可高效感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,表达并分泌ERα-36-Fc重组蛋白,显著抑制EGFR/ERK信号通路。Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的制备为进一步开展靶向ERα-36的肿瘤基因治疗研究奠定基础。     

五倍子有效组分的分离纯化及抗弧菌活性分析北大核心CSCD

中药五倍子是一种具有高药用价值的漆树科植物的寄生虫瘿。本研究利用高速逆流色谱技术分离得到五倍子的7种组分,分离溶剂体系为:乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5,v/v/v)。利用微量热仪测定五倍子各分离组分对弧菌G1-1的抑制曲线,通过细菌生长速率常数和药物浓度之间的关系拟合公式,计算出各组分对菌株G1-1的最低抑菌浓度。结果表明,五倍子各分离组分均对菌株G1-1具有一定抑制作用,其中组分P5对弧菌G1-1的抑制效果最佳,最低抑菌浓度为0.10 mg/m L。该研究建立了一种分离制备中药材有效组分和筛选评价其生物活性的方法,为中药有效组分应用于防控水产动物细菌性疾病提供理论依据及参考。     

基于蛋白质结构预测的胰岛素样生长因子-1的制备及活性分析北大核心CSCD

为了更经济高效地制备胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1),本研究采用计算机模拟技术对3种IGF-1融合蛋白进行蛋白质结构预测与分子对接,筛选出酶切最适配的IGF-1融合蛋白表达形式。利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株,获得重组子;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后,对菌体的破菌上清进行亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析纯化得到目的蛋白;通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1进行活性测定。结果显示,构建的IGF-1融合蛋白原核表达载体序列正确,获得的重组子在25℃、0.05 mmol/L IPTG诱导16 h时融合蛋白为可溶性表达,经初步纯化、凝血酶酶切、再次纯化后可获得纯度大于90%的IGF-1目的蛋白,在建立的活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×10^(5)U/mg,与市售标准品接近。本研究建立了一条用于制备IGF-1的完整工艺路线,为IGF-1药物的研制及工业化生产奠定基础。     

两种柳珊瑚Anthogorgia caerulea和Menella kanisa的化学成分及其抗海洋污损生物附着活性研究北大核心CSCD

采用多种色谱分离技术,从北部湾的两种柳珊瑚Anthogorgia caerulea和Menella kanisa分离出7种次级代谢产物,运用MS、1H NMR和13C NMR等波谱方法并结合文献对照分别鉴定为N-(1-羟甲基-2-羟基)3,6-二烯-十七烷基-十六脂肪酸酰胺(1),邻苯二甲酸二丙酯(2),3-(2-苯乙基)苯酚(3),对甲氧基苯甲酸甲酯(4),邻苯二甲酸二己酯(5),梾木甙(6),次黄嘌呤核苷(7),其中化合物1为新化合物,其他化合物均首次从小月柳珊瑚(Menella kanisa)和花柳珊瑚(Anthogorgia caerulea)中分别分离得到。除化合物3,7外均显示出抗海洋污损生物藤壶幼虫附着能力,其中以化合物6的活性最好,化合物1的活性次之,其抗藤壶幼虫附着EC50分别为6. 89,8. 72μg/m L。     

花青素单一成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷抑制B16-F10细胞增殖和迁移的机理北大核心CSCD

本研究旨在探讨花青素单一成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside, Cy-3-glu)对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10增殖和迁移的影响,并阐明相关机理。用不同浓度Cy-3-glu处理B16-F10细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率,划痕法检测细胞迁移情况,流式细胞仪检测细胞周期,real-time PCR检测细胞周期相关基因的m RNA表达水平,Western blot检测p-AKT、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的相对表达水平,并用小动物活体成像仪检测B16-F10细胞在C57BL/6J小鼠体内的生长和迁移情况。结果显示,Cy-3-glu能明显抑制体外B16-F10细胞的生长(P <0.001)和迁移(P <0.01),使细胞周期阻滞在S期。Cy-3-glu作用后p-AKT (P <0.05)、N-cadherin和vimentin (P <0.001)表达水平显著下降,E-cadherin表达水平升高(P <0.05)。饲喂Cy-3-glu饲料的肿瘤模型C57BL/6J小鼠肿瘤大小和重量显著减小(P <0.05),肿瘤的转移水平也明显降低。以上结果提示,Cy-3-glu通过抑制PI3K/AKT信号、调节细胞黏附和迁移信号使B16-F10细胞周期停滞在S期,最终抑制其在体内和体外的增殖和迁移。