褪黑素抑制原代培养鸭肾上皮细胞c—fos的表达

本研究采用Fos蛋白免疫组化染色方法观察了胎牛血清对原代培养鸭肾上皮细胞c-fos表达的刺激作用及褪黑素的阻断作用,以每一视野Fos染色阳性细胞的百分比为指标,每组实验观察14至17个视野,实验结果显示,正常对照组平均每视野Fos染色阳性细胞为44．31±2．77％,胎牛血清刺激组为63．07±3．93％,明显高于对照组IP＜0．01）,胎牛血清加10^-6mol/L褪黑素组为35．29±3．22％,明显低于单纯胎牛血清刺激组（P＜0．01）,但与对照组无明显差异（P＞0．05）,该结果表明褪黑素可以抑制原代培养鸭肾上皮细胞c-fos表达。     

猫纹状皮层神经元整合野的形状和范围

用正弦调制的移动光栅测量了１２０个猫纹状皮层神经元在长度和宽度方向上的空间整合特性。结果表明：（１）大多数细胞的传统感受野具有长宽相近的结构,然而它们的整合野多数是宽而短或者窄而长的长条形。（２）整合野大小为传统感受野的２—７倍,平均为３．７倍。简单细胞与复杂细胞整合野的大小没有显著差别。（３）随着感受野的视网膜偏心度的增加,整合野大小有逐渐增大的趋势。（４）感受野靠近视网膜垂直中线的细胞,其整合野可以跨越中线进入同侧视野;在两半视野中整合野的范围没有显著差异,但是同侧视野整合野的作用强度明显弱于对侧视野。以上结果提示,初级视皮层神经元能够对大范围内的图形特征进行整合,这种整合作用来自两侧视野。     

小鼠FAAP蛋白对细胞黏附的影响

黏着斑相关蛋白(focal adhesion associated protein,FAAP)由小鼠D10Wsu52e基因编码,在进化上十分保守,但该蛋白质的生物学功能并不清楚．为此,首先通过细胞组分分离的方法研究了FAAP蛋白分布的细胞组分,结果表明FAAP主要存在于细胞质和细胞膜中．细胞蛋白表达量分析表明,细胞中FAAP与黏连蛋白受体(LR)表达量呈现正相关性．同时,细胞黏附实验表明,FAAP与LR对细胞黏附影响类似,也能够抑制细胞的黏附．这些实验结果为深入研究FAAP蛋白功能提供了依据．     

SDF—1α对单核细胞的黏附作用

目的探讨pcDNA3．1-基质细胞衍生因子1α重组质粒对单核细胞的黏附作用。方法将pcDNA3．1-2基质细胞衍生因子1α质粒用脂质体的方法导入人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中,G418筛选细胞克隆。通过逆转录聚合酶链反应法在转录水平检测基质细胞衍生因子1α在转基因ECV304细胞中的表达。在6孔板上种植转染基质细胞衍生因子1α基因的ECV304细胞,加THP-1细胞37℃孵育30min,磷酸缓冲液轻洗3次,去除未黏附细胞,倒置显微镜下计数上、下、左、右、中5个视野,取其平均值得到每个视野黏附单核细胞数。结果获得了稳定表达基质细胞衍生因子1α基因的ECV304细胞克隆,pcDNA3．1-基质细胞衍生因子1n重组质粒对单核细胞具有黏附作用。结论基质细胞衍生因子1α对单核细胞具有明显黏附作用。     

PIWIL4在人卵巢癌中的表达及其功能研究

采用半定量RT-PCR方法检测人卵巢透明细胞癌ES-2细胞中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4 mRNA表达水平,以及PIWIL4在卵巢癌组织和癌旁正常组织中的表达情况．设计并化学合成针对PIWIL4的siRNA,用脂质体转染法将其转入ES-2细胞内,通过MTT和克隆形成实验,观察PIWIL4-siRNA对ES-2细胞生长活性和增殖能力的影响．半定量RT-PCR实验结果发现,ES-2细胞中,PIWIL4相对PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3,其表达水平最高(P < 0.05),而且PIWIL4在卵巢癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P < 0.01)．MTT实验和克隆形成实验结果显示,转染PIWIL4-siRNA的ES-2细胞生长活性和克隆形成率明显低于对照组(P < 0.05)．由此得出结论：PIWIL4在卵巢癌细胞系ES-2细胞表达较高,且它在卵巢癌组织中的表达明显上调,同时PIWIL4-siRNA可有效抑制ES-2细胞的生长活性和增殖能力,提示PIWIL4可能与卵巢癌发生、发展相关．     

芬戈莫德通过鞘氨醇-1-磷酸信号通路抑制肝癌细胞迁移的实验研究

目的 探讨鞘氨醇-1-磷酸(SIP)信号通路及其抑制剂芬戈莫德(FTY720)在体外实验中对不同侵袭潜能人肝细胞癌(HCC)细胞迁移能力的作用。方法通过Real-time PCR和免疫印迹的方法比较低侵袭潜能HCC细胞MHCC-97L和高侵袭潜能HCC细胞MHCC-97H中S1P信号通路关键分子及下游促迁移信号通路的表达与活性水平。使用外源性S1P刺激MHCC-97L细胞,并使用siRNA干扰MHCC-97H细胞中S1P受体1(S1PR1)的表达,通过划痕愈合实验和Transwell实验检测HCC细胞迁移能力的变化。最后使用FTY720处理MHCC-97H细胞,观察S1P及其下游信号通路表达及活性的变化,并研究FTY720对MHCC-97H细胞迁移能力的影响。两组间数据比较采用t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析。结果高侵袭潜能MHCC-97H细胞中,S1PR1、鞘氨醇激酶1(SphK1)及鞘氨醇激酶2(SphK2)的相对表达量分别为5.94±0.78、1.64±0.30及1.48±0.28,高于低侵袭潜能MHCC-97L细胞的1.00±0.06、1.00±0.06及1.00±0.09,差异具有统计学意义(t=10.96,3.575,2.841;P均0.05)。MHCC-97H细胞中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表达水平及活性以及S1PR1下游与细胞迁移能力密切相关的Src、粘着斑激酶(FAK)和Janus激酶2(JAK2)/信号转导子和转录激活子3(STAT3)信号通路活性明显高于MHCC-97L细胞。外源性S1P可促进MHCC-97L细胞的划痕愈合能力。MHCC-97L的Transwell细胞迁移实验显示:S1P刺激组迁移过膜细胞数为(178.33±10.01)个/视野,显著多于空白对照组的(88.00±8.54)个/视野,差异具有统计学意义(F=116.60,P0.01)。相反的,使用siRNA干扰MHCC-97H细胞中S1PR1表达后,细胞的划痕愈合能力受到明显抑制,Transwell实验显示:阴性对照组迁移过膜细胞数为(209.33±4.51)个/视野,而S1PR1特异性siRNA转染组迁移过膜细胞数为(98.67±9.02)个/视野,显著少于阴性对照组,差异具有统计学意义(t=19.01,P0.01)。FTY720作为S1P通路抑制剂,同样抑制了MHCC-97H细胞的划痕愈合能力,Transwell实验同样显示:FTY720处理组迁移过膜细胞数为(58.67±6.03)个/视野,显著少于对照组的(203.33±10.41)个/视野,差异具有统计学意义(t=20.833,P0.01)。FTY720的作用机制可能在于通过下调SphK1和S1PR1,抑制下游促迁移信号通路的活性,并进一步抑制HCC细胞的迁移。结论 S1P信号通路参与了HCC细胞的迁移,而FTY720作为一种具有抗HCC活性的免疫抑制剂,可能通过下调S1P及其下游信号转导,抑制HCC细胞的迁移能力。     

花青素能减轻阿尔茨海默症模型细胞的氧化损伤

氧化胁迫在阿尔茨海默症(AD)的发病过程中起重要作用．花青素是一种广泛存在于植物中的黄酮类物质．实验结果表明,100 μmol/L 的花青素可以有效地缓解AD模型细胞氧化胁迫,具体表现为,降低AD模型细胞的H₂O₂易感性,减少胞内ROS和[NO]_i．c-Jun氨基端激酶(JNK)是氧化胁迫导致细胞损伤的重要信号途径．实验结果显示花青素可以有效地抑制氧化胁迫对JNK的激活．提示花青素的抗氧化胁迫作用与JNK信号途径有关．因此,花青素可以作为一种氧化胁迫因子的清除剂来保护AD模型细胞,有望用于AD的辅助治疗．     

"细胞大小与物质运输的关系"模拟实验的改进

人教版普通高中课程标准实验教材“分子与细胞”模块部分设计了一个模拟实验,该实验是用琼脂块（内含酚酞试液）模拟细胞,用NaOH模拟被细胞吸收的物质。因NaOH溶液遇酚酞试液变粉红色,就可以通过观察琼脂块“细胞”变成粉红色的过程,了解到NaOH扩散进入了“细胞”。再通过测量Na0H扩散进入了“细胞”的深度,比较不同体积的琼脂块“细胞”吸收物质的速度．来探究细胞大小与物质运输的关系。笔者在试做该实验时,感觉到由于NaOH属于强碱．有一定的腐蚀性．再加上用量较大,给实验带来一定的危险性,在分组实验时学生可能会有较大的心理压力。不利于完成实验。所以设想以淀粉代替酚酞,碘液替换NaOH来改进该实验．通过再次试做取得了较好效果．制备方法如下。     

靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对LoVo细胞侵袭和增殖能力的抑制作用

通过构建针对Ｎ-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的小片段发夹状RNA(shRNA)干扰表达质粒,研究了shRNA表达质粒沉默GnT-Ⅴ基因后对LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响．设计了靶向GnT-Ⅴ基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染人结肠癌LoVo细胞,通过G418筛选建立稳定低表达GnT-Ⅴ基因的细胞株．分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测shRNA对GnT-Ⅴ基因mRNA及蛋白质表达的影响．并通过CCK-8增殖实验、异质黏附实验、划痕愈合实验、趋化运动实验、细胞侵袭实验评价pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA对人结肠癌LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响．实验成功地构建了GnT-Ⅴ shRNA表达质粒,并且该质粒明显下调GnT-Ⅴ的表达,LoVo GnT-Ⅴ/1564和LoVo GnT-Ⅴ/2224的mRNA水平的抑制率分别为82%和71.5%,蛋白质水平的抑制率分别为68%和56%．选择干扰效率较高的LoVo GnT-Ⅴ/1564进行进一步实验．CCK-8增殖实验显示,与阴性对照组相比,LoVo GnT-Ⅴ/1564的增殖受到明显抑制(P < 0.001),尤以72 h为著;下调GnT-Ⅴ表达可增强LoVo细胞的黏附能力( t = -3.357,P < 0.01),而显著抑制LoVo细胞的趋化运动能力( t = 44.051,P < 0.001);划痕实验结果也显示抑制GnT-Ⅴ表达延长LoVo细胞的愈合时间;用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验结果显示,LoVo GnT-Ⅴ/1564和LoVo GnT-Ⅴ/NC的穿膜细胞数分别为(5.10 ± 1.25)个和(39.55 ± 2.16)个,GnT-Ⅴ/1564组较阴性对照组明显减少( t = 61.626,P < 0.001)．结果表明,靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表达质粒可以显著降低GnT-Ⅴ的表达,从而抑制LoVo细胞的增殖、迁移和侵袭能力,因此,该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗结直肠癌的有效靶点．     

大鼠新鲜分离DRG神经元胞体膜谷氨酸受体亚型及其分布

本文目的是研究ＤＲＧ神经元膜谷氨酸受体亚型的分布及其共存情况。实验在ＤＲＧ分离细胞上应用膜片带技术记录ＮＭＤＡ－,ＫＡ－和ＱＡ／ＡＭＰＡ－激活电流。在受检的３７个细胞中７０．３％的细胞对ＮＭＤＡ敏感;１８．９％的细胞对ＫＡ敏感;５６．８％的细胞对ＱＡ敏感。其分布的情况是：单独存在一种受体的细胞为１５个;二种受体共存的细胞为１３个;三种受体共存的细胞为４个．另外有４个细胞三种受体均无。     

共轭亚油酸单体诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的PPARγ信号通路研究

cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA是共轭亚油酸(CLA)二种抑瘤活性最强的主要单体．在以前报道二者诱导乳腺癌细胞凋亡的工作基础上,进一步探讨共轭亚油酸单体诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的途径及机制．采用RT-PCR和　　Western blot等方法,证实了CLA在SKBr3细胞中可显著提高PPARγ 的转录及蛋白质表达水平,并发现CLA对PPARγ与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase3的表达影响呈同步相关性,并表现出时间和剂量依赖性．通过PPARγ 抑制剂GW9662实验表明它们之间存在协同关系．首次提出了PPARγ -Bcl-2-Caspase3信号通路的SKBr3细胞凋亡途径,为CLA有望作为PPARγ新型调节剂诱导肿瘤细胞凋亡在临床应用提供实验证据．     

组蛋白去乙酰化酶3通过抑制AICD维持T细胞自稳

为探讨组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)在T细胞自稳中的作用,采用LoxP-cd4cre酶系统在胸腺CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞(DP)中敲除hdac3基因．hdac3基因敲除小鼠不影响T细胞在胸腺中的发育,但导致外周T细胞显著降低,而且,hdac3基因敲除的外周T细胞主要以活化/效应/记忆表型为主．机制分析表明,hdac3基因敲除的外周T细胞凋亡增加并伴随细胞增殖加速,同时,Fas 和Fas配体阳性细胞比率以及Fas配体的表达显著增加．体外TCR活化不影响正常外周T细胞的凋亡,但导致hdac3基因敲除的外周T细胞凋亡显著增加．实验结果表明,HDAC3通过抑制活化诱导的细胞凋亡维持外周T细胞自稳．     

IGF-1抑制妊娠合并糖尿病诱导的鼠胚胎细胞凋亡

为研究妊娠合并糖尿病对孕妇及胎儿产生危害的机制,构建妊娠合并糖尿病的昆明小鼠动物模型,检测不同浓度葡萄糖对体外培养胚泡细胞生长的影响．观察不同浓度胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)对体外高糖环境胚泡细胞发育的影响,利用细胞核DNA双染实验观察不同浓度IGF-1作用下胚泡细胞的凋亡．采用实时定量PCR(RT-PCR)分析不同凋亡相关基因在体外培养胚泡中的表达情况．结果显示,随着葡萄糖浓度的增加,胚泡细胞总数减少,高浓度葡萄糖(≥30 mmol/L)则能显著性抑制胚泡细胞的生长(P < 0.01)．RT-PCR检测发现妊娠合并糖尿病小鼠的胚泡igf-1表达下调,且与葡萄糖的浓度成正相关．凋亡相关基因bcl-2和bcl-xl的表达随着体外IGF-1培养浓度的增加而表达上调,而p53基因和凋亡相关基因Bax的表达则下调．细胞凋亡实验显示,随着IGF-1浓度的增加,体外培养胚泡细胞的凋亡逐渐降低,当IGF-1浓度达到100 μg/L时,几乎未发现细胞凋亡．因此,高血糖能抑制胚泡细胞的生长发育,导致igf-1的表达下调,而IGF-1能抑制胚泡细胞的凋亡,有利于胚泡细胞的生长发育．     

“细胞大小与物质运输的关系”实验的改进研究

在“细胞大小与物质运输的关系”的实验中,教材选用琼脂块（含酚酞）模拟细胞,NaOH模拟被细胞吸收的物质。通过对实验的改进研究．提出以下改进方法：以“琼脂块－碘液”替代“酚酞-NaOH”;设计专门模具制作琼脂块;蒸发含碘的琼脂块以使琼脂块重复利用。通过改进,实验操作性强,效果明显。     

靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌CaSki细胞的抑制作用

以RNA干扰技术为手段,HPV编码的癌蛋白E6为靶标．探讨靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌细胞生物学行为的影响,并试图阐明该实验的临床意义．构建靶向HPV16-E6的siRNA表达载体,应用体外转染试剂转染HPV16-E6阳性的宫颈癌CaSki细胞．以RT—PCR检测CaSki细胞中E6蛋白的mRNA的表达．借助细胞色素c测定来分析细胞凋亡相关分子的表达和活性．从而研究靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的分子机制．RT．PCR检测结果表明,将靶向HPV16-E6的siRNA的表达载体瞬时转染到HPV16-E6阳性的CaSki细胞后,其所舍E6蛋白质和mRNA的表达下调;Westernblotting栓出抑凋亡蛋白Bcl．2的表达亦告下调;细胞色素C释放实验结果显示,HPV16-E6siRNA能够诱导细胞色素c从线粒体释放到细胞浆中。从而诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA为研究重要致瘤蛋白HPV16-E的功能开辟了新途径,给HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供新的实验依据．并探索了HPV感染及宫颈癌的新基因疗法．     

过表达TRAF2降解外源性绿色荧光蛋白

TRAF2是机体免疫与炎症反应中具有重要作用的蛋白,有E3连接酶活性;GFP是一种受到激发光照射后可产生绿色荧光的蛋白,常用于蛋白质的细胞共定位研究,并显示与GFP融合表达靶蛋白在细胞中的位置．我们实验发现共转染表达质粒pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3,可引起转染细胞绿色荧光减弱．Western印迹实验证明TRAF2可以降解GFP,并且这种降解是通过蛋白酶体途径进行的．为进一步确定这种降解的特异性,在HEK293细胞中共转pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3-LNX后,发现随着TRAF2表达量增加,融合蛋白GFP-LNX减少;而共转质粒pCMV-myc-TRAF2与pCMV-myc-LNX后,未发现LNX蛋白表达减少,表明TRAF2对GFP的降解具有相对特异性．GFP是人类细胞中并不存在的蛋白,TRAF2能够将其降解可能意味着TRAF2参与了细胞抗病原体感染的过程．     

铜绿假单胞菌Las系统信号分子对小鼠巨噬细胞影响的体外研究

对于包括铜绿假单胞菌在内的众多微生物而言,群体感应系统是细菌表达毒力因子的重要调节子．Las和Rhl是群体感应两个主要组成部分．Las和Rhl分别受自诱导剂N-3-氧化十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C₁₂-HSL)和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(C₄-HSL)的影响．最近的研究进展显示群体感应分子尤其是3-oxo-C₁₂-HSL具有调节宿主免疫系统的能力．本实验展示了3-oxo-C₁₂-HSL可以诱导鼠源巨噬细胞(RAW264.7)的凋亡和吞噬作用．把合成的3-oxo-C₁₂-HSL加入RAW264.7细胞培养基中,发现细胞生活力以一种依赖于3-oxo-C₁₂-HSL的浓度(6.25 to 100 μmol/L)和培养时间(2 to 24 h)的方式逐渐丢失．同样,我们观察到3-oxo-C₁₂-HSL的细胞毒活性,用3-oxo-C₁₂-HSL处理的细胞出现细胞形态上的改变,这一改变表明3-oxo-C₁₂-HSL处理的细胞加速凋亡,这一点同时也被其他多个标准(caspases3、8和9,线粒体膜电位,磷脂酰丝氨酸的表达)所证实．中性红吞饮实验证明,3-oxo-C₁₂-HSL会显著地减小RAW264.7细胞的吞噬能力(P < 0.05)．同时,高浓度的3-oxo-C₁₂-HSL会降低RAW264.7细胞对铜绿假单胞菌的吞噬作用(P < 0.001)．这些数据表明3-oxo-C₁₂-HSL能特异性地促进细胞凋亡的诱导和RAW264.7细胞吞噬能力的减小．这可能和3-oxo-C₁₂-HSL诱导的细胞毒性有关．最终我们的实验数据证明,群体感应信号分子3-oxo-C₁₂-HSL在铜绿假单胞菌感染的致病机理中扮演着重要的角色．     

粘附分子CDl46是影响滋养层细胞侵入行为的关键分子

前期研究观察到一种现象,在正常妊娠的胎盘中细胞粘附分子CDl46选择性地表达在侵入性滋养层细胞中,而在滋养层细胞侵入不足的先兆子痫病人的胎盘中CDl46表达降低或缺失．本文进一步研究了CDl46分子影响滋养层细胞侵入行为的作用机理．免疫荧光实验显示CDl46分子选择性地表达在具有侵袭能力的中间滋养层细胞,而在非侵入性的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞中不表达．细胞功能实验表明,影响滋养层细胞侵入性的两个关键要素,即细胞迁移和基质金属蛋白酶的分泌,都受到CDl46特异抗体的显著抑制．这些研究结果提示,粘附分子CDl46是影响细胞侵入行为的关键分子．这为深入研究胚胎植入和肿瘤浸润的分子调控机理提供了一个关键的分子模型．     

新书介绍

细胞生物学实验方案 近年来．细胞生物学领域取得了迅速的发展和进步。细胞生物学工作者对实验技术的需求日益增长,其中的许多技术也适用于分子生物学和分子遗传学。本书收录了许多很实用的细胞生物学实验方案,具体表现在：     

褪黑素抑制原代培养鸭肾上皮细胞c－fos的表达

本研究采用Ｆｏｓ蛋白免疫组化染色方法观察了胎牛血清对原代培养鸭肾上皮细胞ｃ─ｆｏｓ表达的刺激作用及褪黑素的阻断作用。以每一视野Ｆｏｓ染色阳性细胞的百分比为指标,每组实验观察１４至１７个视野。实验结果显示,正常对照组平均每视野Ｆｏｓ染色阳性细胞为４４．３１±２．７７％,胎牛血清刺激组为６３．０７±３．９３％,明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）,胎牛血清加１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ褪黑素组为３５．２９±３．２２％,明显低于单纯胎牛血清刺激组（Ｐ＜０．０１）,但与对照组无明显差异（Ｐ＞０．０５）。该结果表明褪黑素可以抑制原代培养鸭肾上皮细胞ｃ─ｆｏｓ表达。