大肠杆菌琥珀酸和乙酸合成途径的删除及其重组菌株的D-乳酸发酵

菌株CICIM B0013-030 (B0013,ack-pta,pps,pflB) 可积累D-乳酸作为主要发酵产物,然而副产物琥珀酸和乙酸的含量分别高达乳酸的11.9％和7.1％。为构建副产物含量低的产D-乳酸重组大肠杆菌菌株,本研究删除了菌株B0013-030的琥珀酸 (frdA) 和乙酸 (tdcDE) 合成途径,并考察了重组菌株在摇瓶和发酵罐中经两阶段发酵 (好氧生长菌体和厌氧发酵产酸) 利用葡萄糖发酵D-乳酸的性能。结果表明,分别构建含有frdA::difGm和tdcDE::difGm突变盒的重组质粒,并利用Red重组系统将突变盒整合于染色体上的目的基因,再利用Xer重组系统去除抗生素抗性基因,依次获得了重组菌株B0013-040B (B0013-030,frdA) 和B0013-050B (B0013-040B,tdcDE)。摇瓶发酵结果表明,frdA基因的删除使得菌株B0013-040B副产物琥珀酸的含量降低了80.8％;在7 L发酵罐中进行乳酸发酵,菌株B0013-040B的D-乳酸产量达114.5 g/L,光学纯度大于99.9％,但仍积累1.0 g/L琥珀酸和5.4 g/L乙酸。进一步删除了tdcD和tdcE基因的菌株B0013-050B,在7 L发酵罐中生产111.9 g/L D-乳酸,乙酸和琥珀酸的合成量分别降低为0.4 g/L,其他副产物含量也维持较低水平,表明该菌株具有较优良的D-乳酸发酵性能。     

产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建

基于产琥珀酸重组大肠杆菌E.coli B0013-1050的琥珀酸合成途径,利用Red同源重组技术结合Xer/dif重组系统敲除富马酸酶基因fumB、fumC,苹果酸酶基因maeB,构建L-苹果酸合成途径,最终得到重组大肠杆菌E.coli2030,该菌株在15 L发酵罐中,产L-苹果酸12.5 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%,同时对发酵产物中主要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。为进一步提高L-苹果酸的转化率,整合表达来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因,构建重组菌E.coli 2040,在15 L发酵罐中产L-苹果酸14 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率提高到60.3%。     

利用温度调节实现新型重组菌高效转化甘油为D-乳酸

油脂水解来源的甘油将是未来发酵工业主要原料之一.文中探索D-乳酸高产大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013-070菌株不同培养温度下好氧与厌氧代谢甘油的特征后,建立并优化了一种新型D-乳酸变温发酵工艺,甘油到乳酸的得率由64％提高到82.6％.另外,在B0013-070中引入了温度诱导型乳酸脱氢酶的转录系统,甘油到乳酸的得率进一步提高到88.9％.     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨

【目的】L-丙氨酸的存在导致Escherichia coli的生长速率显著降低,最终会降低发酵过程中L-丙氨酸的体积合成速率。用温度调节基因开关(λpR-pL)高效、动态调控重组E. coli菌株菌体生长与L-丙氨酸合成过程,使两者相协调。【方法】以野生型E. coli B0016为出发菌株,敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因(ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA、dadX),获得菌株B0016-060B。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的L-丙氨酸脱氢酶基因(alaD)克隆于pL启动子下游,并在B0016-060B菌株中表达,获得菌株B0016-060B/pPL-alaD,进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和L-丙氨酸发酵性能。【结果】竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量,仅形成极少量的乙酸、琥珀酸和乙醇。28 °C下菌株B0016-060B/pPL-alaD几乎不合成L-丙氨酸,可保证菌体快速生长;而在42 °C下可高效合成L-丙氨酸。经发酵罐发酵,可合成67.2 g/L L-丙氨酸,体积生产强度达到2.06 g/(L·h)。【结论】通过发酵培养温度的简单切换,分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成。     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合...     

重组大肠杆菌利用废纸水解液发酵产L-乳酸

前期通过基因工程手段,构建了一株大肠杆菌工程菌E.coli WL204,该菌株可以有效利用木糖为底物发酵产L-乳酸。以废纸为发酵原料,研究该菌株利用木质纤维素发酵产乳酸的特性。原料以稀硫酸预处理后,经纤维素酶酶解,得到的水解液用Ca(OH)2脱毒后,接种E.coli WL204,在7L发酵罐中发酵72h,每100g废纸可以产生31g乳酸,糖酸转化率为79%。结果表明,E.coli WL204可以木质纤维素原料为底物发酵生产L-乳酸,具有一定的工业化开发潜力。     

丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

首次从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆得到L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldhL)基因,并将其连接到pSE380表达载体上,得到重组质粒pSE380ldhL,将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJl44大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达产物的分子量约为34kD,摇瓶发酵后用HPLC检测分析L-乳酸产量为2.4g/L,纯度达到99.9%,不需要再进行手性分离,为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸打下基础。     

木糖发酵生产高纯度D-乳酸大肠杆菌工程菌LHY02的构建

高效利用木糖发酵生产D-乳酸或其他生物质产品,是充分利用木质纤维素的一个关键问题。以高效利用木糖产L-乳酸的Escherichia coli WL204为出发菌株,采用RED基因置换技术将ldhL基因置换为ldhA基因,获得一株能利用木糖产D-乳酸的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli LHY02,该菌株利用10%木糖发酵,D-乳酸产量达到84.4 g/L,产物光学纯度达到99.5%。此外,该菌株仍然具有较好的利用葡萄糖产D-乳酸的能力。     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在重组大肠杆菌JH12中的过量表达

以工程菌Escherichia coli SZ85基因组为模板,克隆得到乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL),连接到pUcm-T载体后,双酶切然后将其连接到表达载体pET-28a上,重组质粒经筛选后转入染色体上含有ldhL基因(来源P.acidilactici)的工程菌Escherichia coli JH12。P.acidilactici的ldhL基因过量表达体系E.coli JH12(pET-28a-ldhL)能利用浓度7%的木糖为碳源进行厌氧发酵,过量表达ldhL使L-乳酸产量提高了10 g/L,达64.86 g/L,糖酸转化率高达96%。     

大肠杆菌副产物合成途径删除提高外源蛋白表达水平

大肠杆菌是应用最广泛的外源基因表达宿主。为探索阻断副产物产生途径对提高大肠杆菌表达外源蛋白的能力,本实验以野生型大肠杆菌菌株为基础,删除其乳酸脱氢酶基因(ldhA),磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(pps)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)。在此基础上,以甘露聚糖酶基因man为报告基因,考察阻断以上代谢途径对大肠杆菌产酶能力的影响。结果显示,以上述三个基因叠加删除的三重突变株为宿主时,重组茵产酶水平最高,比酶活达到158.3 U/mg,相比野生出发菌株提高82.3%。     

Genetically switched d-lactate production in Escherichia coli

During a fermentation process, the formation of the desired product during the cell growth phase competes with the biomass for substrates or inhibits cell growth directly, which results in a decrease in production efficiency. A genetic switch is required to precisely separate growth from production and to simplify the fermentation process. The ldhA promoter, which encodes the fermentative d-lactate dehydrogenase (LDH) in the lactate producer Escherichia coli CICIM B0013-070 (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA), was replaced with the λ p(R) and p(L) promoters (as a genetic switch) using genomic recombination and the thermo-controllable strain B0013-070B (B0013-070, ldhAp::kan-cI(ts)857-p(R)-p(L)), which could produce two-fold higher LDH activity at 42°C than the B0013-070 strain, was created. When the genetic switch was turned off at 33°C, strain B0013-070B produced 10% more biomass aerobically than strain B0013-070 and produced only trace levels of lactate which could reduce the growth inhibition caused by oxygen insufficiency in large scale fermentation. However, 42°C is the most efficient temperature for switching on lactate production. The volumetric productivity of B0013-070B improved by 9% compared to that of strain B0013-070 when it was grown aerobically at 33°C with a short thermo-induction at 42°C and then switched to the production phase at 42°C. In a bioreactor experiment using scaled-up conditions that were optimized in a shake flask experiment, strain B0013-070B produced 122.8g/l d-lactate with an increased oxygen-limited productivity of 0.89g/g·h. The results revealed the effectiveness of using a genetic switch to regulate cell growth and the production of a metabolic compound.     

理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌

利用代谢工程手段理性改造野生大肠杆菌的莽草酸(Shikimic acid,SA)合成途径及相关代谢节点,以构建高产莽草酸的工程菌株.根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶基因(aroL、aroK),葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响.aroL、aroK的删除阻断了莽草酸进一步转化成为莽草酸-3-磷酸,初步提高莽草酸的累积.删除ptsG基因使大肠杆菌PTS系统部分缺失,细胞通过GalP-glk(半乳糖透性酶-葡萄糖激酶)途径,利用ATP将葡萄糖磷酸化后进入细胞.利用该途径运输葡萄糖能够减少PEP的消耗,使得更多的碳代谢流进入莽草酸合成途径,从而显著提高了莽草酸的产量.在此基础上删除ydiB基因,阻止了莽草酸合成的前体物质3-脱氢奎宁酸转化为副产物奎宁酸(Quinic acid,QA),进一步提高了莽草酸的累积.初步发酵显示4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍.     

Evaluation of Genetic Manipulation Strategies on d-Lactate Production by Escherichia coli

In order to rationally manipulate the cellular metabolism of Escherichia coli for D: -lactate production, single-gene and multiple-gene deletions with mutations in acetate kinase (ackA), phosphotransacetylase (pta), phosphoenolpyruvate synthase (pps), pyruvate formate lyase (pflB), FAD-binding D-lactate dehydrogenase (dld), pyruvate oxidase (poxB), alcohol dehydrogenase (adhE), and fumarate reductase (frdA) were tested for their effects in two-phase fermentations (aerobic growth and oxygen-limited production). Lactate yield and productivity could be improved by single-gene deletions of ackA, pta, pflB, dld, poxB, and frdA in the wild type E. coli strain but were unfavorably affected by deletions of pps and adhE. However, fermentation experiments with multiple-gene mutant strains showed that deletion of pps in addition to ackA-pta deletions had no effect on lactate production, whereas the additional deletion of adhE in E. coli B0013-050 (ackA-pta pps pflB dld poxB) increased lactate yield. Deletion of all eight genes in E. coli B0013 to produce B0013-070 (ackA-pta pps pflB dld poxB adhE frdA) increased lactate yield and productivity by twofold and reduced yields of acetate, succinate, formate, and ethanol by 95, 89, 100, and 93%, respectively. When tested in a bioreactor, E. coli B0013-070 produced 125 g/l D-lactate with an increased oxygen-limited lactate productivity of 0.61 g/g h (2.1-fold greater than E. coli B0013). These kinetic properties of D-lactate production are among the highest reported and the results have revealed which genetic manipulations improved D-lactate production by E. coli.     

大肠杆菌甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)的敲除及其对甘油产量的影响

利用Red重组系统构建了大肠杆菌JM109甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)缺失的双突变菌株JM109B,然后将表达酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1)和3-磷酸甘油酯酶基因(HOR2)的质粒pSE-gpd1-hor2转化到JM109B突变菌株中,在含1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中37℃发酵24 h,甘油的最高产量为5.61 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍;在30 L发酵罐中发酵28 h,甘油的最高产量为103.12 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍,是原始菌株BL21/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.41倍,葡萄糖转化率为50.39%。     

L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达

为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产L-乳酸的途径,以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LA - 04 -01基因组为模板,设计引物扩增L-乳酸脱氢酶基因L-ldh.将该基因连接到表达栽体pET-28a(+)上,并转化大肠杆菌Top10.通过卡那霉素抗性平板筛选,提取重组质粒pET28a-L-ldh并测序,结果正确.将pET28a-L-ldh转化大肠杆菌BL-21( DE3),通过卡那霉素抗性平板筛选,得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌.经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白条带,L-乳酸脱氢酶比酶活力达到9.44 U/mL.该基因工程菌通过摇瓶发酵,L-乳酸产量达到3 g/L,成功构建出一条在大肠杆菌中生产L-乳酸的新途径.