聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

用套式多聚酶链反应技术监测乙型肝炎病毒的母婴垂直传播

用套式多聚酶链反应（Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）技术对１６９对ＨＢｓＡｇ及ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ阳性孕妇及其新生儿外周血清进行了ＨＢＶ－ＤＮＡ检测。１０３对ＨＢｓＡｇ阳性孕妇及其新生儿外周血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为７２．８％和３３．０％;６６对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ双阳性的孕妇及其新生儿外周血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为８６．４％和４３．９％。对５５例ＨＢｓＡｇ及ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ阳性产妇产后的初乳进行了ＨＢＶ－ＤＮＡ检测,结果ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为３６．４％。结果表明ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ双阳性的孕妇及其新生儿外周血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率较ＨＢｓＡｇ单阳性的孕妇及其新生儿要高,其初乳中ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率也高。还对１０５例注射了乙肝疫苗及高价乙肝特异性免疫球蛋白的６月龄婴儿的外周血清进行了ＨＢＶ－ＤＮＡ检测,结果有２３例阳性。     

单纯疱疹病毒的PCR直接基因分型

本文利用ＰＣＲ技术建立一种对ＨＳＶ直接基因分型的方法。在ＨＳＶ－Ⅰ、Ⅱ两型的ＤＮＡ多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物（ＨＤＰ－Ｂ）和两条型特异的下游引物（ＨＤＰ－１、ＨＤＰ－２）。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在ＨＳＶ－Ⅰ产生５４３ｂｐ条带,ＨＳＶ－Ⅱ产生３７２ｂｐ条带,据此在基因水平上对ＨＳＶ进行分型。５株不同来源的ＨＳＶ（２株Ⅰ型,３株Ⅱ型）分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的ＤＮＡ不产生特异反应,敏感性可达１ｆｇ。应用该法对１５１份临床可疑ＨＳＶ感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。     

PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究

目的为鉴定新分离毒株是否为B病毒.方法根据ScinicarielloF报道的引物,用PCR方法扩增BV147、HSV-1、HSV-2,对扩增产物进行SacⅡ内切酶消化.结果这一对引物可同时对这3种病毒进行扩增,但只有BV147的扩增产物可被SacⅡ内切酶切开.对BV147扩增片段克隆测序的结果证实,其与美国B病毒E2490株部分基因(UL27)相对应位置的核苷酸同源性为100%.结论初步建立了检测B病毒DNA的PCR方法并测定了新分离病毒毒株的部分基因序列,证明新分离的病毒为B病毒.     

Micro-droplet Digital Polymerase Chain Reaction and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Technologies Provide Highly Sensitive and Accurate Detection of Zika Virus

The establishment of highly sensitive diagnostic methods is critical in the early diagnosis and control of Zika virus(ZIKV)and in preventing serious neurological complications of ZIKV infection. In this study, we established micro-droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR) and real-time quantitative PCR(RT-qPCR) protocols for the detection of ZIKV based on the amplification of the NS5 gene. For the ZIKV standard plasmid, the RT-qPCR results showed that the cycle threshold(Ct) value was linear from 10~1 to 10~8 copy/l L, with a standard curve R~2 of 0.999 and amplification efficiency of 92.203%;however, a concentration as low as 1 copy/l L could not be detected. In comparison with RT-qPCR, the dd PCR method resulted in a linear range of 10~1–10~4 copy/l L and was able to detect concentrations as low as 1 copy/l L. Thus, for detecting ZIKV from clinical samples, RT-qPCR is a better choice for high-concentration samples(above 10~1 copy/l L),while ddPCR has excellent accuracy and sensitivity for low-concentration samples. These results indicate that the ddPCR method should be of considerable use in the early diagnosis, laboratory study, and monitoring of ZIKV.     

人传染性软疣病毒快速PCR检测方法的建立

为了能够对传染性软疣病毒(MCV)感染做出准确快速的实验室诊断,从14例临床MCV患者皮疹处提取获得病毒DNA,设计引物并进行PCR扩增获得预期的167bp的片段,经测序并与已报道的序列比对,完全一致。而使用痘病毒科其他病毒的特异引物(正痘病毒和副痘病毒属)则没有特异扩增条带。将病毒DNA进行系列稀释后行PCR扩增,结果表明PCR检测方法的敏感性为5×10-4ng/μL。     

用PCR技术检测活检组织和鼻咽上皮细胞内EB病毒基因

选用Epstin-Barr病毒(EBV)基因组内部重复序列1(IR1)片断作为多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增引物,用于检测了31例不同病例活检组织和4例新鲜鼻咽组织经体外培养6周以上的新生上皮细胞内EBV基因,其中检出EBVDNA:高分化鼻咽癌5/5,低分化鼻咽癌4/4,何杰金氏病5/5,非何杰金氏病0/2,头颈其他肿瘤1/6,鼻咽慢性炎症0/5,正常鼻咽组织0/4;新生上皮细胞DNA抽提物;低分化鼻咽癌2/2,炎症0/1,正常人胚鼻咽上皮0/1;携带EBV基因组细胞系(Raji,B_(95-8)各1)2/2,致淋巴细胞转化之B_(95-8)病毒为10~(-4),PCR检测10~(-4)～10~(-6)均阳性,10~(-7)未检出。结果表明EBV与鼻咽癌与何杰金氏病有关,常规石蜡包埋切片仅8μm×0.1mm~2,贮存时间至三年仍可用于PCR检测EBV DNA,证实PCR是一种快速、灵敏和特异测捡EBV基因组的方法,可作为肿瘤和疚病病毒病因回顾性调直研究的有力手段。     

聚合酶链扩增技术用于药品中沙门菌的快速检查

目的:由于中国药典中规定的沙门菌检查采用微生物培养法,其操作繁琐、培养周期长,本研究拟建立一种快速定性检测沙门菌的方法以替代药典中繁琐耗时的微生物培养法。方法:取10 m L含动物类药材的口服制剂,分别加入0.096~96 cfu的沙门菌,同时以大肠埃希菌作为干扰对照菌,设置沙门菌污染组、大肠埃希菌污染组、沙门菌及大肠埃希菌混合污染组及阴性对照组共4个实验组,采用多重聚合酶链扩增技术(PCR)对供试品溶液进行扩增检测,分别考察该方法对沙门菌检出的专属性、准确性、灵敏度以及适用性。结果:所建立的方法检验周期短,仅需30小时;专属性好,能准确区分沙门菌与干扰对照菌;结果准确,检测结果与药典方法检验结果一致;灵敏度高,最低检测限为1 cfu。结论:本方法便捷高效、结果准确,可为药品检验中的沙门菌检查提供一种新手段。     

实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10^-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。     

PCR法

PCR法自1985年公布后一下子就成为了一项基础技术。能够从极微量的DNA中进行扩增的PCR法，也开始向RNA研究以及定量分析方面发展。现在也被广泛用于诊断、动植物育种等实用过程中。此讲由宝生物制品开发中心主任向井博之执行董事讲解。[编者按]     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术,结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV）,采用MHV－3,MHV－A59病毒株感染DBT细胞,37℃培养,待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物,进行RT－PCR扩增,结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA,同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

RT—PCR技术检测呼吸道合胞病毒RNA方法的建立

为了建立一种快速诊断呼吸道合胞病毒（RSV）感染的方法,根据RSVN基因的核苷酸序列,设计合成了一对引物,经RT-PCR扩增,可检出RSVRNA该引物不能检测流感病毒、副流感病毒RNA。应用该法可检出疑为RSV感染的婴幼儿鼻咽分泌物中的病毒RNA且比病毒分离法敏感,特异性与免疫荧光法一致。结果表明RT－PCR法具有快速、敏感、特异的优点,可用于RSV感染患儿的临床诊断。     

新型MGB探针在沙眼衣原体实时PCR检测中的应用

为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用 PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464～2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在10⁰～10⁹ DNA拷贝每反应范围内,C_t值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）和DNA拷贝数呈线性关系（r＞0.990）;对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

人呼吸道合胞病毒活疫苗研究进展

人呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要原因,也可导致免疫缺陷病人及老年人群显著发病和死亡.人呼吸道合胞病毒疫苗已被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为全球最优先发展的疫苗之一.经过50多年的研究,尤其是随着重组技术和反向遗传学的出现,对RSV疫苗的研究取得了重要进展,...     

Specific Detection of Buckwheat Residues in Processed Foods by Polymerase Chain Reaction

A specific and qualitative detection method for buckwheat in foods using the polymerase chain reaction (PCR) was developed. Trace amounts of buckwheat in commercial food products were qualitatively detected by this method. It should be reliable for detecting buckwheat residues in processed foods and practical for monitoring the labeling system for allergenic food materials.     

Biosynthetic Enhancement of the Detection of Bacteria by the Polymerase Chain Reaction

Molecular viability testing (MVT) was previously reported to specifically detect viable bacterial cells in complex samples. In MVT, brief nutritional stimulation induces viable cells, but not non-viable cells, to produce abundant amounts of species-specific ribosomal RNA precursors (pre-rRNA). Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is used to quantify specific pre-rRNAs in a stimulated aliquot relative to a non-stimulated control. In addition to excluding background signal from non-viable cells and from free DNA, we report here that MVT increases the analytical sensitivity of qPCR when detecting viable cells. Side-by-side limit-of-detection comparisons showed that MVT is 5-fold to >10-fold more sensitive than standard (static) DNA-targeted qPCR when detecting diverse bacterial pathogens (Aeromonas hydrophila, Acinetobacter baumannii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, and Staphylococcus aureus) in serum, milk, and tap water. Sensitivity enhancement may come from the elevated copy number of pre-rRNA relative to genomic DNA, and also from the ratiometric measurement which reduces ambiguity associated with weak or borderline signals. We also report that MVT eliminates false positive signals from bacteria that have been inactivated by moderately elevated temperatures (pasteurization), a condition that can confound widely-used cellular integrity tests that utilize membrane-impermeant compounds such as propidium iodide (PI) or propidium monoazide (PMA) to differentiate viable from inactivated bacteria. MVT enables the sensitive and specific detection of very small numbers of viable bacteria in complex matrices.