一株人源性轮状病毒的分离及适应性培养

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质.方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测.阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖动力学分析评价,采用轮状病毒P[8]G1型阳性血清进行病毒中和鉴别试验.结果:通过检测为A组轮状病毒,基因组为4∶2∶3∶2排列,基因分型G1P [8]型,在MA104细胞中传代后转至Vero细胞上适应培养可观察到CPE;电镜观察可见典型轮状病毒形态.毒株在Vero细胞上增殖到第10代,复制稳定,且感染性滴度达到7.25 log CCID50/ml,增殖高峰为96h.中和鉴别试验证实病毒培养液只包含轮状病毒,无其他病毒污染.结论:从腹泻样品中分离得到一株人源轮状病毒毒株,命名为ZTR-68株,该分离株具有良好的组织培养适应性,遗传稳定性,为进一步研究其生物学性质和疫苗制备提供了基础.     

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

乙型流感病毒Vero细胞高产适应株传代稳定性研究

由于能快速、大规模生产以应对随时可能暴发的流感,细胞流感疫苗已成为当今流感疫苗的主要研发方向,而选育流感病毒Vero细胞高产适应株对于细胞流感疫苗的研发至关重要。本文旨在研究流感病毒Vero细胞高产适应株BX-51BVa(By)在Vero细胞上的传代稳定性,以证明该毒株是否可以作为制备Vero细胞流感疫苗的种子批。以Vero细胞高产株BX-51BVa(By)在Vero细胞上连续传代50次,测定其血凝效价和感染性滴度,并通过型别鉴定及基因序列测定考察传代过程中生物学性状的稳定性。结果显示BX-51BVa在Vero细胞连续传代50次,血凝效价维持在256～512,感染性滴度稳定在1×107TCID50/mL左右,型别未发生改变,HA和NA氨基酸序列与流行株BX-51B相比没有发生变化。本研究发现B型流感病毒重配株能够稳定地在Vero细胞连续传代,可以作为制备Vero细胞流感疫苗的种子批。     

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI) 0. 01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384～448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化; HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

在中国卢龙县发现G5型人A组轮状病毒

轮状病毒是引起我国儿童重症腹泻的主要病原。按照WHO轮状病毒监测方案,对2003年间河北省卢龙县开展了以医院和社区为基础的小于5岁儿童轮状病毒腹泻的监测,发现一株新型轮状病毒。该病毒用传统分型引物(G1、G2、G3、G4)扩增不出条带,对其VP7基因全序列测定和分析后确定该毒株为G5型。这是我们在亚洲首次发现的人类G5型轮状病毒。该毒株与猪的G5型C134毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88·6%和95·4%,与非洲发现的人的G5型毒株MRC3105核苷酸和氨基酸的同源性为89·9%和94%,与巴西发现的IAL-28毒株核苷酸和氨基酸的同源性为87·2%和93·3%。系统发生树分析表明:卢龙毒株LL36755与其他已经报告的两种猪和一种人类的G5型毒株可能具有相同的起源。这是人轮状病毒G5型首次在亚洲国家发现,而且该毒株可能是由人类轮状病毒与动物轮状病毒毒株自然重组产生。     

蓝舌病病毒基因节段2与6的重配导致病毒血清型与增殖特性的改变

【背景】蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)是一种侵染反刍动物的虫媒病毒,基因重配可引起病毒的快速变异。【目的】通过我国强致病性BTV-16型毒株与弱致病性BTV-4型毒株间Seg-2与Seg-6基因节段的重配,探讨病毒基因重配与表型变异之间的关系。【方法】采用全长cDNA扩增与高通量测序获取BTV-16/V158的全基因组序列,构建病毒的真核表达质粒,通过免疫荧光与WesternBlot检测目的蛋白表达;通过RT-PCR、体外转录与细胞转染等方法建立BTV反向遗传体系并获取基因重配病毒;通过蚀斑分析、增殖曲线分析与血清中和试验,比较亲本毒株与基因重配病毒在生物学特性上的差异。【结果】获取的BTV-16/V158毒株基因组大小为19 186 bp,与中国和印度BTV-16型毒株具有最近的亲缘关系;将表达BTV VP1、VP3与NS2的真核表达质粒转染细胞,检测到目的蛋白的表达;将BTV的7种真核表达质粒与基因组ssRNA共转染BHK-21细胞,成功拯救出与亲本毒株生物学特性一致的病毒;将BTV-16/V158毒株的Seg-2与Seg-6替换为BTV-4/YTS4毒株的对应基因节段,拯救出基因重配病毒BTV-16/V158-RG (BTV-4/S2,S6);与亲本病毒相比较,基因重配病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑变小,增殖能力减弱,血清型由BTV-16型转化为BTV-4型。【结论】建立了我国流行BTV-16型毒株的反向遗传体系,BTVSeg-2与Seg-6的基因重配可引起病毒在细胞上增殖能力的改变与血清型改变。研究结果为BTV基因重配致病毒变异与新型基因工程疫苗的研究提供了基础。     

2018-2019年福州腹泻住院儿童A组轮状病毒全基因组分析

了解2018-2019年福州市五岁以下腹泻住院儿童标本中A组轮状病毒(RVA)基因组特征.通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对49份RVA阳性标本进行核酸扩增,对扩增到的40份标本进行全基因组二代测序,获得G1P[8]型RVA毒株7株,G9P[8]型RVA毒株33株.根据VP7节段分型,40株RVA毒株中有30株G9-Ⅵ亚型、3株G9-Ⅲ亚型和7株G1-Ⅰ亚型;根据VP4节段分型,40株RVA毒株均属于P[8]-3亚型.全基因组核苷酸序列分析表明,除了VP7节段外,序列差异比较大的有NSP4和NSP1两个节段.本研究获得11株G9P[8]型Waa-ike株(G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1),22株NSP4节段重配的G9P[8]-E2株(G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1),在测序的33株G9P[8]型RVA毒株中G9P[8]-E2重配株占66.7％.7株G1P[8]型RVA毒株均为Wa-like株.研究结果表明,2018-2019年福州地区流行的RVA毒株中G9P[8]-E2重配株已经成为优势株,为了更全面了解福州地区RVA毒株的遗传变异情况,后续还需加大标本量持续进行监测.     

一株瘤胃源乳酸利用菌的分离鉴定及其体外代谢特性

【目的】从饲喂高精料的本地山羊瘤胃内分离到一株利用乳酸并能产生大量丙酸的菌株L9,并进一步研究了该菌在调控瘤胃微生物发酵中的作用。【方法】采用厌氧培养技术,结合形态、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析结果。【结果】该菌株被鉴定为反刍兽新月形单胞菌（Selenomonas ruminantium）。该菌株体外代谢特性研究表明,L9可利用乳酸作为唯一碳源,该菌在24h内可对90mmol／L的乳酸完全降解。体外摸拟瘤胃急性酸中毒的发酵试验结果表明,以淀粉为底物时,与对照组相比,添加菌株L9可显著降低瘤胃微生物体外培养体系中乳酸浓度,提高pH值,提高总挥发性脂肪酸和丙酸浓度,并显著降低乙酸与丙酸的浓度比（P〈0．05）。【结论】结果显示,菌株L9是一株可代谢乳酸,促进丙酸生成,提高总挥发性脂肪酸浓度的有益瘤胃细菌。     

我国猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0901分离株分子特征

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大。PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV 30个氨基酸的缺失。为了进一步阐明该分离株的分子特征,本研究对该毒株全基因序列进行了测定和分析,结果该毒株基因组全长15 439 bp,其中包含29 nt Poly(A)。与高致病性PRRSV毒株JXA1比较,核酸序列同源性为96.7%,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为97.2%和98.5%,但NSP2基因无30个氨基酸的缺失;与传统型毒株ch-1a比较,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为92.9%和91.5%;基因进化树分析结果显示其介于高致病性和传统PRRSV毒株之间。与其它不同毒力PRRSV分离株基因序列比较,未发现明显重组信号。不同毒力毒株氨基酸残基比对分析结果显示,15个位点潜在毒力相关氨基酸残基中,该毒株有9个与高致病性PRRSV毒株一致,3个与高致病性PRRSV毒株不同,但与传统型和JXA1疫苗株相同,1个位点只与JXA1疫苗株相同,2个与其它毒株都不相同。表明该分离株与高致病性PRRSV密切相关,PRRSV流行毒株变异与基因突变有关,从而为该病毒毒力基因定位研究奠定了基础。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株酸性蛋白p9基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码p9蛋白的基因,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白,其氨基端带有6个组氨酸的标签,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中,重组的酸性蛋白p9可与马传贫阳性血清样品发生反应,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究 。     

无细胞百日咳疫苗效价检定用攻击菌液氮保存的稳定性

为了考察无细胞百日咳疫苗效价检定用攻击菌在液氮中保存的稳定性,对液氮保存1~7年的4~9代百日咳攻击菌随机抽取7~11批次样品,采用LD50检测并经统计学处理,分析其样品的毒力变化。试验结果显示,4~9代的百日咳攻击菌液氮保存5年,毒力仍能达到《中华人民共和国药典》三部(2005版)的要求;保存6年和7年,4~7代的百日咳攻击菌毒力仍符合上述要求,8、9代的攻击菌毒力的合格率分别为84%和40%。试验证实,无细胞百日咳效价检定用攻击菌液氮保存5年具有良好的稳定性,可用于无细胞百日咳疫苗的效价检定。     

Clinico-laboratory and seroepidemiological examinations of children immunized with live measles vaccine prepared from genetically homogeneous strain Moscow-5

The results of the clinico-laboratory and epidemiological study of a newly developed live measles vaccine obtained from strain Moscow-5, genetically homogeneous and cloned from strain JI-16, are presented. The data indicate that the vaccine obtained from strain Moscow-5 is safe and possesses low reactogenicity and high immunological potency, thus meeting all requirements for vaccinal preparations.     

Complete Genome Sequence of a Novel H9N2 Subtype Influenza Virus FJG9 Strain in China Reveals a Natural Reassortant Event

A/chicken/FJ/G9/09 (FJ/G9) is an H9N2 subtype avian influenza virus (H9N2 AIV) strain causing high morbidity that was isolated from broilers in Fujian Province of China in 2009. FJ/G9 has been used as the vaccine strain against H9N2 AIV infection in Fujian Province of China. Here, we report the complete genome sequence of FJ/G9 with natural six-way reassortment, which is the most complex genotype strain in China and even in the world so far. The present findings will aid in understanding the complexity and diversity of H9N2 subtype avian influenza virus.     

Production and experimental testing of the polyvalency of corpuscular vaccine for the prevention of Pseudomonas aeruginosa infections II. Experimental testing of the immunogenicity of polyvalent corpuscular Pseudomonas aeruginosa vaccine

Newly developed P. aeruginosa vaccine has been shown to be safe and apyrogenic for experimental animals. Immunization with the vaccine in a single injection of 0.5 ml has been found to ensure the protection of 80--98% of mice from lethal infection caused by virulent vaccine strains, with the exception of P. aeruginosa strain No. 1311, for 9 weeks. Immunity to P. aeruginosa strain No. 1311 develops only by day 56 after vaccination. No sharp correlation between the specific agglutinin level and the degree of protective effect induced by the immunization of animals with the polyvalent vaccine has been established. The vaccine has been shown to possess high immunogenicity in respect to clinical P. aeruginosa strains belonging to different serotypes (homo- and heterological vaccine strains).     

Safety of Brucella abortus strain RB51 in deer mice

Brucella abortus strain RB51 is an approved brucellosis vaccine for use in cattle that may have potential as an oral vaccine for use in elk (Cervus elaphus) and/or bison (Bison bison). This study was designed to determine effects of strain RB51 on deer mice (Peromyscus maniculatus), a nontarget species that could have access to treated baits in a field situation. In February 1994, 90 mice were orally dosed or intraperitoneally injected with 1 x 10(8) colony forming units strain RB51 and 77 controls were similarly dosed with sterile saline. At weekly intervals through early April 1994, 4 to 6 mice from each group were euthanized, gross necropsies performed, spleens and uteruses cultured, and tissues examined histologically. All orally inoculated mice cleared the infection by 6 wk post-inoculation (PI). While most of the injected mice cleared the infection by 7 wk PI, a few required 9 wk. There were minimal adverse effects attributable to strain RB51. Apparently, strain RB51 would not negatively impact P. maniculatus populations if it were used in a field situation. Also, deer mice appear to be able to clear the vaccine in 6 to 9 wk, thus the probability of these mice transmitting the vaccine to other animals is low.     

Characterization of a mutant strain of Rhodovulum sulfidophilum lacking the pufA and pufB genes encoding the polypeptides for the light-harvesting complex 1 (B 870)

Contradictory results on the effectiveness of energy transfer from the light harvesting complex 2 (LH2) directly to the reaction center (RC) in mutant strains lacking the core light-harvesting complex 1 (LH1) have been obtained with cells of Rhodobacter capsulatus and Rhodobacter sphaeroides. A LH1⁻ mutant of Rhodovulum sulfidophilum, named rsLRI, was constructed by deletion of the pufBA genes, resulting in a kanamycin resistant photosynthetically positive clone. To restore the wild type phenotype, a complemented strain C2 was constructed by inserting in trans a DNA segment containing the pufBA genes. Light-induced FTIR difference spectra indicate that the RC in the rsLRI mutant and in the C2 complemented strains are functionally and structurally identical with those in the wild type strain, demonstrating that the assembly and the function of the RC is not impaired by the LH1 deletion. The photosynthetic growth rate of the rsLRI strain increased with decreasing light intensity. At 50 W m⁻² no photosynthetic growth was observed. These results indicate that the light energy harvested by the LH2 complex was not or inefficiently transferred to the RC; thus most of the energy necessary for photosynthetic growth is in the LH1⁻ strain directly absorbed by the RC. It is supposed that in the mutant strain, RC and LH2 cannot interact in an efficient way.