豌豆NAD激酶的提纯及活力测定

NAD激酶(ATP:NAD 2′-磷酸转移酶EC 2.7.1.23简称NADK)催化NAD磷酸化生成NADP,其活性随着酶的纯化而降低,其激活依赖于Ca~(2 )激活的钙调素(Calmod-ulin简称CaM),两者之间成剂量关系,因此,可用该酶定量CaM。活性CaM一般采用酶法[如环腺苷酸磷酸二酯酶(PDE)和红血球Ca~(2 )-ATP酶等]定量,但采用这类酶时,酶活性易受磷酯与脂     

检测钙调素的NAD激酶法

drClinmillWUShu－Pins,ZHANGXue－on,WANGJian－Ping,WANGYou－Al（HdriN～］ned．8彻加部办呼050016）磷酸二酯酶（PDE）定量测定活性钙调素（CaM）是国内外普遍应用的酶学方法［1］,而用NAD激酶（NADK）法检测活性CaM,虽早已提出[3],但应用并不普遍,国内尤为如此。多年来,我们研究了提取植物NADK及测定活性的方法[2],并用此法于红萝卜,玉米、豌豆、水稻、白茫、衣藻、四膜虫,人血细胞等多种生物的活性CaM的定性和定量检测,证实它与PDE法相比,有提取较为简易,灵敏度高,检测程序简便等多种优点;此外,…     

用磷酸二酯酶定量检测植物钙调素方法的改进

从磷酸二酯酶(PDE)提取方法、钙调素(CaM)到定反应时间、测定体系中的Ca^2 和cAMP浓度、样品处理及活性计算等方面对叶正华等测定钙调素的PDE法作了改进。实验表明,改进后的方法使PDE的提取比较较简便快捷,CaM检测过程中的误差减小,结果的准确性、重复性和可比性都更好,可用于多个样品的同时测定。     

大黄蒽醌衍生物与环核苷酸磷酸二酯酶、钙调素相互作用的研究

大黄蒽醌衍生物是中药大黄的主要成份。该类衍生物与钙调素(calmo-dulin,CaM)依赖的磷酸二酯酶(PDE)的相互作用表明:它们可作用子钙调素。其中,大黄酸结合CaM并抑制CaM依赖的磷酸二酯酶(CaM-PDE);而大黄素、大黄酚和芦荟大黄素既刺激CaM-PDE的活力,又刺激PDE的基础活力,其作用机制尚待阐明;当有Ca~(2+)或无Ca~(2+)条件下测定时,大黄酸对PDE基础活力均无影响。表明:象其它的CaM拮抗剂一样,大黄酸能抑制钙调素依赖的PDE的活力。     

钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析*

我们曾经证明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)拮抗剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)有抑制人胃癌细胞增殖和诱导细胞形态向正常分化的效应。本文用CaM活性测定箱方法测定了TFP处理的人胃癌MGC-803细胞胞质内的CaM活性。同时也测定了磷酸二酯酶(Phosphodiesterase.PDE)活性的变化。结果表明TFP选择性抑制胞质内依赖Ca~(2+)/CaM的PDE活性。氨茶碱有抑制CaM活化PDE的作用。本文对TFP作用机理及在调控癌细胞增殖及分化中的意义进行讨论。     

牛脑Ca~(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的纯化和鉴定

通过一系列层析法,首次从牛脑纯化得到胶凝电泳匀一的Ca~(2+)/CaM PKⅡ。凝胶过滤法测定全酶分子量为550kD,SDS-PAGE法测定亚基分子量为55kD,推测牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ由十个相同的亚基组成。该酶活性绝对依赖于Ca~(2+)和CaM,以63kD PDE同工酶为底物,其AC_(50)分别为0.85μmol/L和0.18μmol/L;以酪蛋白为底物,其AC_(50)分别为0.22μmol/L和0.06μmol/L。牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ旣能催化63kD PDE同工酶等多种蛋白或酶磷酸化,又能进行自身磷酸化。该酶催化63kD PDE同工酶最大磷酸参入量为1mol/mol亚基。磷酸化型63kD PDE同工酶的Ca~(2+)的AC_(50)高于非磷酸化型。     

钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析

我们曾经证明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)拮抗剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)有抑制人胃癌细胞增殖和诱导细胞形态向正常分化的效应。本文用CaM活性测定箱方法测定了TFP处理的人胃癌MGC-803细胞胞质内的CaM活性。同时也测定了磷酸二酯酶(Phosphodiesterase.PDE)活性的变化。结果表明TFP选择性抑制胞质内依赖Ca²⁺/CaM的PDE活性。氨茶碱有抑制CaM活化PDE的作用。本文对TFP作用机理及在调控癌细胞增殖及分化中的意义进行讨论。     

乌头碱对依赖钙调蛋白的环核苷酸磷酸二酯酶的拮抗作用

钙调蛋白(CaM)是生物体中一种多功能调节蛋白。已发现多种药物如吩噻嗪、局部麻醉剂、Ca~(2+)通道阻断剂、化合物48/80、长春花生物碱以及粉防己碱和小檗胺等都对CaM有拮抗作用,抑制CaM活化的环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)、红细胞膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase等的活性。但是上述药物中,除后三种外,其余的多为合成药。为了进一步从分子水平上探     

GM_1激活环核苷酸磷酸二酯酶的作用

神经节苷脂GM1能激活CaM依赖性环核苷酸磷酸二酯酶,其AC50为1．56μg／ml．这种作用并不一定依赖Ca2＋的存在．在有Ca2＋存在时,GM1对PDE的最大激活活性低于CaM,仅为CaM的80．4％;没有Ca2＋存在时,GM1与CaM对PDE有同样的最大激活活性（100％）．GM1能使CaM对PDE的激活曲线左移,AC50降低,但不改变CaM对PDE的最大激活活性．三氟啦嗪能使GM1激活的PDE的活性降低,其IC50为16．3μmol／L．     

钙调蛋白及其调节酶PDE在鸡脑胚胎发育过程中的变化

钙调蛋白(CaM)参与脑中多种细胞过程的调节,推测它与大脑的分化发育有关。本实验研究了鸡脑从胚胎早期(原基)至大脑成熟各发育阶段可溶部分的CaM及其调节酶——环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的含量或活力变化。未经孵育的鸡胚中检测不出CaM,在孵育3—14天的胚脑中CaM含量逐渐增加:总CaM增加了3倍,活性CaM增加了4倍;而且在鸡脑细胞分裂分化最活跃的期间(皮质和髓质形成期间,即孵育8—14天),活性CaM的增加尤为显著(增加近3倍)。提示CaM与脑细胞的分裂分化有关。PDE的活力出现晚于CaM5天,随着胚龄增加,不断上升,提示它与脑细胞的分裂分化无直接关系,可能与大脑的功能活动有关。本实验还研究了鸡脑发育期中可逆性钙结合蛋白的变化。     

小麦黄化胚芽鞘的细胞壁钙调素和钙调素结合蛋白

小麦黄化胚芽鞘经苯基琼脂糖亲和层析提取和纯化,其细胞壁CaM在有钙和缺钙时SDS电泳呈现不同的迁移率;依赖Ca~(2 )与苯基疏水结合;在紫外吸收光谱上具有五个特征峰;对PDE的激活剂量反应曲线和从非活性状态向活性状态转变时所需的Ca~(2 )浓度均和胞内CaM相同,说明细胞壁CaM和胞内CaM具有相同的基本理化特性。采用CaM琼脂糖亲和层析,发现在小麦细胞壁中存在CaM结合蛋白,其中以分子量为40.7 kD的 CaM结合多肽为主。细胞壁CaM结合蛋白不具有过氧化物酶、ATP酶或酸性磷酸酯酶的活性。     

Zn^2＋对植物光系统Ⅱ的影响及与钙调素的关系

研究发现2.0mmol/L Zn~(2+)对白兰瓜幼苗离体叶绿体PS Ⅱ电子传递,如DCIP光还原和光合放氧及叶绿素a荧光有抑制作用,而这种抑制作用能分别被外加的Ca~(2+)(10mmol/L)和CaM(10μg/ml)所逆转。同时还发现CaM拮抗剂CPZ对叶绿素a荧光具有抑制作用,并且这种抑制能被外源CaM所逆转。通过PDE法证实了CaM在PS Ⅱ中的存在。因此,我们认为Za~(2+)对植物光合作用的影响与CaM有关,而且Zn~(2+)对PS Ⅱ电子传递的抑制很可能是通过CaM来实现的。     

钙调蛋白的构效关系及其与药物的相互作用

钙调蛋白(calmodulin,CaM)作为环核苷酸磷酸二酯酸(PDE)的内源性活化因子,于六十年代后期由张怀耀首先发现,它是细胞内Ca~(2+)的重要受体,与Ca~(2+)结合后发生构象变化而激活,又调节着细胞内Ca~(2+)的浓度。它不具有酶的活性,却能通过激活细胞内广泛的酶谱,调控细胞的基本功能。二价阳离子竞争性地取代Ca~(2+)的结合后能影响CaM活性,组织内还存在有CaM的内源性抑制因子,竞争性地与CaM结合而抑制CaM的活性。CaM与靶酶的相互作用也能被很多药物所抑制,这或许与药物的作用机制有关。     

固定化胰蛋白酶活力的测定方法探讨

对自制的固定化胰蛋白酶(Immobilization Trypsin,ITP)分别经过冷冻干燥、真空干燥后定量测定其酶活力,与由湿态直接定量法(DQA)测定的活力进行比较。试验表明,直接定量方法测定的酶活力比前两者高,而且操作简单。     

玉米根尖细胞内钙调素的胶体金免疫电镜定位

钙调素(Calmodulin,简称CaM)抗体是研究CaM的特异性生物探针,常被用来研究CaM的定量和分布.CaM分布的研究不仅对揭示细胞内CaM的作用位点有重要意义,而且还可深入探讨CaM的功能.     

自旋标记钙调蛋白与酸枣仁皂甙A相互作用研究

中草药有效成份酸枣仁皂甙A是钙调蛋白CaM的一种天然非竞争性拮抗剂。利用氮氧自由基马来酰亚胺衍生物标记CaM研究了二者的相互作用。结果表明,每分子CaM至少可以结合二个分子的酸枣仁皂钙A,二者的作用影响CaM上Lys残基主要是75,94)的环境,推测酸枣仁皂钙A是通过疏水作用结合到CaM分子两端的疏水沟区。通过比较三氟拉嗪TFP与酸枣仁皂甙A的结构特点,抑制性质与结合位点,提出了CaM调节环核苷酸磷酸二酯酶PDE的模式。     

2,4-D和6-BA对向日葵下胚轴愈伤组织生长及钙调蛋白的影响

自 Anderson和 Cormier(1979)从植物中分离提取钙调蛋白(简称 CaM)后,对它的结构功能进行了广泛的研究,发现 CaM在光合作用(Barr等 1980)、酶的激活(Matsumoto等 1983)、蛋白磷酸化(Gideon等1982)等方面均起着重要作用。还证明CaM与生长素、细胞分裂素以及α-淀粉酶的分泌等有密切关系(Elliott 1983,Raghothama等1983;Saunders等1982)Elliott认为植物激素的促     

酸枣仁皂甙A与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

文中报导了本实验室最近发现的一种新型钙调蛋白(CaM)天然拮抗剂——酸枣仁皂甙A,它能显著地抑制CaM活化PDE的活力.为研究它与CaM间的相互作用,本实验还制备了与天然CaM具有相同激活PDE能力的丹磺酰钙调蛋白(D-CaM).D-CaM的荧光光谱研究表明,酸枣仁甙A的加入诱导CaM分子的疏水位点更加暴露,从而增强丹磺酰基团的荧光发射量子产率.桔抗剂与CaM间的结合是绝对依赖Ca~(2 )的.荧光滴定的结果证明此结合的解离常数为2.8μM.酸枣仁皂甙A能进一步加强三氟啦嗪(TFP)所诱导的D-CaM荧光增强.这结果暗示,它不与TFP竞l争CaM上相同的结合位点.     

我国禾谷类病毒病的病原问题 Ⅸ.应用酶联免疫测定法检测小麦丛矮病植株

酶联免疫测定法(简称ELISA)是一种具有高度特异性和敏感性的检测方法。它的基本原理是:利用双功能试剂制备抗体(或抗原)与酶的结合物,该结合物保留了免疫学和酶的活性,酶与底物溶液产生的颜色反应可以定量测定。此法能在极低浓度下定量检测特异的抗原(或抗体),适用于疾病的大规模普查和流行病的调查。自E.Engvall 和Van Weemen 在1971年分别建立酶联免疫测定法以来,目前已广泛地应用于各种传     

我国禾谷类病毒病的病原问题 Ⅸ.应用酶联免疫测定法检测小麦丛矮病植株

酶联免疫测定法(简称ELISA)是一种具有高度特异性和敏感性的检测方法。它的基本原理是:利用双功能试剂制备抗体(或抗原)与酶的结合物,该结合物保留了免疫学和酶的活性,酶与底物溶液产生的颜色反应可以定量测定。此法能在极低浓度下定量检测特异的抗原(或抗体),适用于疾病的大规模普查和流行病的调查。自E.Engvall和