野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA的分子克隆及其特征

酚氧化酶在昆虫的免疫防御机制中起着重要作用。利用RT-PCR和RACE方法,克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因,获得了其cDNA序列。该序列长2 134 bp,含有一个2 082 bp的完整开放阅读框,编码一个由693个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。组织特异性表达分析表明了该基因在野桑蚕5龄幼虫的血细胞、体壁、头部、精巢、卵巢、脂肪体和中肠等组织及其不同的发育阶段均有表达。这些结果为进一步研究野桑蚕酚氧化酶原基因的功能提供了分子基础。     

棉铃虫羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及组织表达

为了从分子水平上研究棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner) 对杀虫剂抗性的产生机理,本文通过RT PCR和RACE方法首次从棉铃虫中肠中克隆了一个羧酸酯酶全长cDNA序列。序列分析表明,该基因包含一个1 794 bp的开放读码框,129 bp的5′UTR和139 bp的3′UTR区域。该基因编码597个氨基酸, 推测编码蛋白质的等电点pI为4.92,分子量为67.1 kD,GenBank登录号为EF547544。通过对氨基酸的同源性分析表明,该羧酸酯酶与斜纹夜蛾Spodoptera litura羧酸酯酶的同源性最高,达60%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在中肠组织中表达量最高,在脂肪体和生殖腺中表达量较低,在头部则不表达。推测该羧酸酯酶基因可能主要参与棉铃虫对外源物质的解毒代谢。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

棉铃虫血淋巴酚氧化酶活性的微量测定

昆虫血淋巴黑化的形成由激活酚氧化酶原的级联系统所引发 ,酚氧化酶在昆虫体液免疫中起着重要作用。用抗凝剂从棉铃虫血淋巴中分离获得了血浆及完整的血细胞 ,以L DOPA为底物 ,牛胰蛋白酶为激活剂 ,测定了血浆及血细胞裂解液中酚氧化酶及酚氧化酶原的活性。结果表明 ,血浆及血细胞中两者都有一定量的分布。这一昆虫血淋巴酚氧化酶的微量测定方法 ,所需样品量少 ,耗时短 ,简便易行。     

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

胸腺素α原基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法从正常成人外周血和胎儿胸腺中分别克隆得到了四种胸腺素α原基因,经序列分析结果表明,克隆的四种ProTα基因的核苷酸序列并不一致。与已报道的胸腺素α原基因进行比较,胎儿胸腺中克隆的胸腺素α原基因几乎无变化,而从成人外周血中所克隆的则变化较大,但变化区域有一定规律,109-120位都有GGGAATGCTAAT碱基的缺失,变化较多的氨基酸集中为天冬氨酸和谷氨酸,而胸腺素α原前28个氨基酸、中心酸性区和末端核定位信号区域变化较小。该结果为胸腺素α原的结构、功能和演化研究提供了信息。     

亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

【目的】昆虫体内酚氧化酶原（PPO）是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶（PO）抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子（Mg²⁺,Cu²⁺和Fe²⁺）对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的V_max为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L。Fe²⁺存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%（P<0.05）;有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu²⁺存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。【结论】结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。     

胆固醇氧化酶基因的克隆与表达

胆固醇是人体中主要的固醇类化合物,人体内胆固醇主要来源于自身的合成,也有一部分来自食物。胆固醇代谢和输送的异常往往与动脉粥样硬化相关联,能够引起心肌梗死、中风、动脉瘤和胆石症等疾病。胆固醇的一些代谢产物如类甾醇和类甾烷酮有致癌作用。所以检测血浆中和食物中胆固醇的含量在临床上具有重要的意义［１,２］。 胆固醇氧化酶可以和胆固醇脂酶和过氧化氢酶复合在一起,作为血浆总胆固醇含量的诊断试剂。也可将这３种酶固定在膜上,做成酶电极,这样使用起来更方便。胆固醇氧化酶能够降低食品中的胆固醇含量,也可以将胆固醇氧…     

口虾蛄proPO基因全长cDNA的克隆与组织表达

口虾蛄是海湾底拖网渔业中具有重要经济价值的种类,分布广泛.其自然资源日渐衰退,人工育苗技术获得成功后,口虾蛄养殖过程中病害问题及其防治应引起足够的重视.为此,拟通过分子生物学手段研究口虾蛄免疫系统的核心酶——酚氧化酶(PO)的分子结构及该基因的组织表达,从而在分子水平上深入探究其免疫机理.采用反转录PCR(RT-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)技术从口虾蛄血细胞中克隆了酚氧化酶原(O-proPO)基因,cDNA全长为2436bp,其中开放阅读框为2142bp,编码713个氨基酸.预测分子量为82446Da,等电点(pI)为8.78.该基因与Genbank上登录的斑节对虾、凡纳滨对虾、罗氏沼虾、短沟对虾、日本对虾proPO基因序列具有较高的同源性,分别为82％、76％、76％、72％、70％.序列分析表明O-proPO为proPO家族中的一个成员,其氨基酸序列中含有多个免疫调节作用位点.系统进化分析显示O-proPO与十足目种类的proPO为同一分支的2个亚群,而后于丰年虫的proPO形成一分支.O-proPO基因表达具有组织特异性,在血淋巴和肠中表达,但在血淋巴中表达量明显高于肠.     

Purification and characterization of prophenoloxidase from cotton bollworm,Helicoverpa armigera

Phenoloxidases are oxidative enzymes, which play an important role in both cell mediated and humoral immunity. Purification and biochemical characterization of prophenoloxidase from cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hübner) were carried out to study its biochemical properties. Prophenoloxidase consists of a single polypeptide chain with a relative molecular weight of 85 kDa as determined by SDS–PAGE, MALDI–TOF MS and LC–ESI MS. After the final step, the enzyme showed 71.7 fold of purification with a recovery of 49.2%. Purified prophenoloxidase showed high specific activity and homology with phenoloxidase subunit‐1 of Bombyx mori and the conserved regions of copper binding (B) site of phenoloxidase. Purified prophenoloxidase has pH optima of 6.8 and has high catalytic efficiency towards the dopamine as a substrate in comparison to catechol and L‐Dopa. The PO activity was strongly inhibited by phenylthiourea, thiourea, dithiothreitol and kojic acid.     

棉铃虫多核型多角体病毒v-cath同源基因的克隆及序列分析

为获得棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(Helicoverpa armigera multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus)基因组序列,采用随机克隆方法,建立HearMNPV的质粒基因文库,并通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得编码组织蛋白酶基因v-cath。该基因阅读框为1026bp,共编码341个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性比较结果表明:HearMNPV的v-cath基因与蓓带夜蛾核型多角体病毒B(Mamestra configurata NPV-B)的同源性最高,而与苹果皮小卷蛾颗粒体病毒(Cydiapomonella GV CpGV)同源性最低,由此认为,杆状病毒科的v-cath基因在进化上存在2种进化方式:一类以点突变为主,基因长度变化不明显;另一类突变以小片段的碱基增减为特征。     

棉铃虫细胞色素P450 cDNA片段的克隆与序列分析

以 5龄实验室敏感品系棉铃虫Helicoverpaarmigera的总RNA为模板 ,采用简并性引物 ,利用反转录 -多聚酶链式反应 (RT PCR)扩增出了 2个新的长度分别为 2 3 7bp和 2 40bp的cDNA片段。序列分析表明 ,2 3 7bp的cDNA片段与棉铃虫P45 0CYP4家族有较高的相似性 ,最高达 73 %;而 2 40bp的cDNA片段与CYP6家族有较高的相似性 ,最高达 49%。     

棉铃虫c-Jun氨基末端激酶基因的克隆、表达谱及对UV-A胁迫的响应

【目的】本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)基因,并对其进行序列和表达模式分析,探讨该基因在棉铃虫生长发育及响应UV胁迫方面的作用。【方法】利用RT-PCR与RACE技术克隆棉铃虫JNK基因,并利用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行分析;采用实时荧光定量PCR技术检测其在棉铃虫不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹、雌雄成虫)、成虫不同组织(去除触角和复眼的头、胸、腹、触角、复眼、足、翅、中肠、卵巢)中及雌成虫在UV-A照射不同时间(0, 30, 60, 90, 120和150 min)下的相对表达量变化。【结果】克隆获得一个棉铃虫JNK基因并命名为HaJNK(GenBank登录号:MH719009),其cDNA序列全长为2 431 bp,开放阅读框(ORF)长1 191 bp,编码396个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为45.01 kD,等电点为6.35,无跨膜结构,无信号肽。系统进化分析显示,棉铃虫HaJNK与其他昆虫JNK具有很高的同源性。发育阶段表达分析表明,HaJNK在棉铃虫卵期表达量最高;组织特异性分析显示该基因在成虫复眼、胸部及卵巢部位特异性表达。UV-A照射能诱导棉铃虫雌成虫体内HaJNK的表达,随着照射时间的延长,其表达量呈现先升高后降低的趋势,在照射60 min时表达量达到峰值。【结论】HaJNK在棉铃虫不同龄期、成虫不同组织和UV-A照射不同时间的雌成虫中差异表达,提示其在响应UV-A胁迫的分子机制中具有重要意义。     

棉铃虫嗅觉受体基因的克隆及组织特异性表达

昆虫嗅觉受体是一个高度变异的蛋白家族,但是其中一类嗅觉受体很特殊,它们在不同昆虫体内高度保守。该文作者从棉铃虫Helicoverpa armigera体内克隆得到了这类受体基因,命名为ORHarm。ORHarm编码473个氨基酸残基,序列中有7个跨膜区,是典型的G蛋白偶联的受体。ORHarm与已经报道的昆虫同类嗅觉受体的同源性在60％以上,与近缘种烟芽夜蛾Heliothis virescens嗅觉受体的同源性高达99.4％。半定量RT-PCR研究表明,ORHarm主要在棉铃虫成虫触角中表达,在喙中也有表达,但表达量较低,在成虫其他的部位不表达;在棉铃虫发育的各个时期,如卵、幼虫、蛹和成虫体内,也都有表达。ORHarm不仅在感受挥发性气味物质的过程中起着重要的作用,而且也参与液态化学刺激的识别过程。     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。