PCR简便快速筛选阳性克隆

目前常用的筛选阳性重组子的方法主要有快提质粒酶切法及杂交筛选法[1] ,但这两种方法均存在不足之处。比如快提质粒法需要提取质粒 ,在筛选大量样品时操作比较繁琐 ;而杂交法存在操作周期长并要使用同位素等不足。由于ＰＣＲ技术具有操作简便且灵敏度极高的特点[2 ] ,近年出现了一些利用ＰＣＲ技术筛选阳性克隆的方法[3] ,但这些方法在制备ＰＣＲ扩增模板时仍然需要提取被筛选样品菌的质粒。我们用溶菌酶处理被筛选样品菌细菌悬液 ,并对悬液加热 ,以使质粒分散于菌细胞之外。然后直接以该悬液为模板 ,使用ＰＣＲ对重组质粒上的特定序列进行…     

植物基因识别及克隆策略研究进展

随着基因组数据的积累,同时识别多个基因、解读其功能,正在成为揭示环境信号调控植物组织分化及器官形成分子机制必不可少的途径。我们从基因组水平、转录水平和蛋白质水平,回顾总结了识别发育及代谢相关基因、解读其功能的一般策略,讨论并比较了各主要策略的优缺点,并提出方法选择的一般原则。     

鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较

从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(P^{blue-ocripx Ks+/-})上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95．6％和96．7％。     

DDRT—PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST

为了避免差异显示技术中的放射性污染。并用之于筛选。克隆精子发生早期的相关基因。分离纯化了小鼠的原始精原细胞及B型精原细胞,提取其总RNA。逆转录获得cDNA,以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性,选取16条差异显著的片段做克隆测序。通过Gen-Bank/Blast比较,有7个片段属于新的EST,且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始精原细胞,提交GenBank获得注册号,从中选取较有意义的3条基因片段通过半定量RT-PCR方法进一步验证其表达特征,和传统的差异显示方法比较,文中所采用的mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果。避免同位素标记带来的放射性污染,结果表明所获得的7个新EST均表现为B型精原细胞中高表达,这些表达升高的基因可能与其后精子发生过程中的一系列特殊现象（如减数分裂,变态成形）有关,为生精细胞的分化做物质上的准备。     

PCR筛选阳性克隆方法的改进

ＰＣＲ筛选阳性克隆具有简便、快速的优点,但常发生假阳性错误。用与载体匹配的引物和目的的基因引物组合进行ＰＣＲ,可以消除假阳性,同时可以判断插入目的基因的方向。     

改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列

对传统的反向PCR技术作了一些改进：用巢式PCR扩增含量极少的靶序列;PCR反应体系中加入5%的甲酰胺以减少非特异性扩增.结果表明,改进的反向PCR体系是克隆人基因组已知片段旁侧序列的高度灵敏、高度特异的方法.     

小麦叶绿体psbA基因PCR扩增及其克隆

利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)对小麦叶绿体的psbA基因进行特异性扩增,并以pBSD+质粒为载体将完整的psbA基因克隆到E.c oli中。通过分子杂交,PCR反应和酶切分析证明,重组质粒pTD1Ⅱ中含有完整的小麦叶绿体psbA基因。     

改良法制备PCR产物克隆载体

将克隆载体平端切割后,向反应体系中加入ｄＴＴＰ,用ＴａｑＤＮＡ聚合酶处理载体,使其３－端带上一个凸出的单碱基Ｔ,修饰后的载体可直接与纯化的ＰＣＲ产物连接。     

Restriction Site-dependent PCR: An Efficient Technique for Fast Cloning of New Genes of Microorganisms

New bioactive proteins need to be screened from various microorganismsfor the increasing need for industrial and pharmaceutical peptide,proteins, or enzymes. A novel polymerase chain reaction (PCR)method, restriction site-dependent PCR (RSD-PCR), was designedfor rapid new genes cloning from genomic DNA. RSD-PCR strategyis based on these principles: (i) restriction sites dispersethroughout genomes are candidacy for universal pairing; (ii)a universal primer is a combination of a 3'-end of selectedrestriction sites, and a 5'-end of degenerated sequence. A two-roundPCR protocol was designed and optimized for the RSD-PCR: amplifythe single strand target template from genomic DNA by a specificprimer and amplify the target gene by using the specific primerand one of the universal RSD-primers. The optimized RSD-PCRwas successfully applied in chromosome walking using specificinternal primers, and cloning of new genes using degeneratedprimers derived from NH₂-terminal amino acid sequence of protein.     

多发性骨髓瘤恶性相关基因快速表达克隆法的建立

为从多发性骨髓瘤细胞中克隆与鉴定恶性相关基因并试图阐明其发病分子机制,建立了一种改进的快速表达克隆法,简单、快捷、直接从多发性骨髓瘤细胞株ARH-77 cDNA文库中克隆恶性相关基因。其特点是常用的表达克隆法与经典的DNA介导的NIH／3T3转染实验相结合,直接从cDNA表达文库中克隆恶性相关基因。首先建立高质量的cDNA表达文库,将cDNA表达文库分成几个基因池,转染NIH／3T3细胞;将转化活性最强的基因池再分成几个亚基因池,转染NIH／3T3细胞;将转化活性最强的亚基因池再分成次级亚基因池,直到获得有明显转化活性的单个cDNA克隆。该技术亦可用于从其他肿瘤细胞中克隆恶性相关基因。     

克隆差异表达基因的新策略

基因表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达.表达量差异的基因克隆技术主要有mRNA差异展示,此技术是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一,但主要存在假阳性率高的不足,针对此缺点,近几年提出了新的策略与方法,如差异消减展示、基于PCR和减法杂交基础上的差异表达基因克隆技术,这些技术具有显著优势.     

Changes of 5＇ Terminal Nucleotides of PCR Primers Causing Variable T-A Cloning Efficiency

T-A cloning takes advantage of the unpaired adenosyl residue added to the 3＇ terminus of amplified DNAs by Taq and other thermostable DNA polymerase and uses a Ilnearlzed plasmld vector with a protruding 3＇ thymldylate residue at each of Its 3＇ termini to clone polymerase chain reaction （PCR）-derived DNA fragments. It Is a simple, reliable, and efficient Ilgatlon-dependent cloning method for PCR products, but the drawback of variable cloning efficiency occurs during application. In the present work, the relationship between variable T-A cloning efficiency and the different 5＇ end nucleotlde base of primers used In PCR amplification was studied. The results showed that different cloning efficiency was obtained with different primer pairs containing A, T, C and G at the 5＇ terminus respectively. The data shows that when the 5＇ end base of primer pair was adenosyl, more white colonies could be obtained In cloning the corresponding PCR product In comparison with other bases. And the least white colonies were formed when using the primer pair with 5＇ cytldylate end. The gluanylate end primers resulted In almost the same cloning efficiency In the white colonies amount as the thymldylate end primer did, and this efficiency was much lower than that of adenosyl end primers. This presumably is a consequence of variability In 3＇dA addition to PCR products mediated by Taq polymerase. Our results offer instructions for primer design for researchers who choose T-A cloning to clone PCR products.     

PCR技术应用的新进展

近年来,随着PCR技术方法学的逐步改进和完善,更加显示出它的实用性.这不仅扩大了其用武之地,也促进了分子生物学的快速发展.文章着重介绍PCR在基因工程和蛋白质工程应用中的某些新进展,包括不需连接的克隆技术、随机引导／定位PCR、cDNA末端随机快速扩增、重组PCR和大引物PCR．     

合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略

随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的培训周期长,不利于以流水线形式进行工程化使用,已经逐步在生物工程领域内被淘汰。文中论述了一系列适于机械化操作的新一代分子克隆技术,即不依赖基因序列和连接反应克隆方法、Gibson组装、聚合酶环形延伸克隆、细胞裂解物体外无痕连接和细胞体内组装克隆。对这些方法的建立、基本原理及应用前景等方面进行了总结,并对其优缺点进行了比较。     

HGV广东株和香港株NS5区部分基因的克隆及序列分析

采用ＨＧＶＮＳ５特异的２对引物,对两个香港株和一个广东株ＨＧＶＲＮＡ进行逆转录套式ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物克隆入ｐＵＣ１９,重组质粒转化ＤＨ５α和ＪＭ１０９菌株。ＰＣＲ和酶切法鉴定阳性克隆,双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列并进行同源性分析。结果发现核苷酸变异呈散在分布,三株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为９３．３％～９４％及９７％～９９．２％,与已报道的中国株（ＣＮ）相比,则同源性分别为９０％～９１．２％和９４％～９６．３％,与美国株（ＰＮＦ２１６１及Ｒ１０２９１）相比,为８７．１％～８９．５％和９５．２％～９７％,而与西非株（ＧＢＶＣ）相比,则达９１．４％～９３．８％和９７％～９７．９％。提示ＨＧＶＮＳ５区核苷酸和氨基酸序列相对保守,不同ＨＧＶ株存在一定的地区差异。     

鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆

为了验证通过ＣＤＮＡ代表性差性分析法（ｃＤＮＡ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ）分离的ＣＤＮＡ序列在鼻咽癌活给组织中的差异表达,并进一不克隆鼻咽癌差异表达基因,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法并结合Ｎｏｔｔｈｅｒｎ杂交确定其转录本的大小,进而充分利用生物信息学对有差异表达ＣＤＮＡ全长进行克隆,并对其基因产物进行了结构和功能预测。结果显示,ＡＦ０９１５     

应用多重PCR技术检测性器官异常患者的性别决定基因

采用针对人SRY基因及X与Y染色体同源序列的两对引物进行多重聚合酶链反应技术检测204例新生儿脐血DNA,男性均显示590bp、 355bp及280bp 3条扩增带,女性只有590bp1条扩增带,性别鉴定准确率为100%。又检测47例性器官异常患,13例社会性别为女性者只出现590bp扩增带,与核型性别结果一致。 34例社会性别为男性者中,有2例SRY基因检测结果阴性,只出现590bp带,核型为46,XX,证明这两例患者社会性别不相符,经病理证实后应诊断为女性假两性畸形。 Abstract:This investigation adapted multiplex PCR technique with two pairs of primer to determine sex according to the human SRY gene and X,Y chromosome analogical sequence.We detected bellybutton blood DNA from 204 newborns.Male revealed three bands:590bp,355bp and 280bp,and females only had one band which was 590bp,the accuracy of sex determination was 100%.47 sexual abnormal patients were tested.The results showed that 13 cases,whose social sex were female,had one 590bp band which consistent with their chromosome type sex.In the rest 34 cases,whose social sex were male,2cases showed,on the contrary,only one 590bp band and their chromosome type were 46,XX.This proved that the two patients did not consistent with their social sex,and pathological analysis showed that they were female pseud-hermaphroditism.