产朊假丝酵母整合表达载体的构建

[目的]构建一个产朊假丝酵母(Candida utilis,C.utilis)整合表达载体.[方法]该载体以质粒pBR322为骨架,包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子和终止子、放线菌酮(CYH)抗性基因和18S rDNA介导的同源整合区.再以木聚糖酶基因为目标基因,插入pGLR9K载体上,构建重组表达载体,电击转化C.utilis.对阳性转化子进行酶活测定,检测其表达情况.[结果]转化子的胞内外都可检测到木聚糖酶酶活,酶活可达60 U/mL.[结论]本实验构建了一个C.utilis载体,并用此载体表达了木聚糖酶基因,本研究将为产朊假丝酵母工程菌在饲料添加剂及食品行业中的应用提供又一个新的实验平台.     

过氧化氢胁迫促进产朊假丝酵母合成谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)在生物细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫时起到非常重要的作用。考察了不同时间不同浓度过氧化氢胁迫和过氧化氢连续胁迫对产朊假丝酵母合成GSH的影响, 发现低浓度过氧化氢的连续胁迫对GSH的合成有明显促进作用。进一步在发酵罐上应用了低浓度过氧化氢(36 mmol/L)持续胁迫策略, 最终GSH产量为922 mg/L, 胞内GSH含量为1.64%, 比对照分别提高了7%和35%。     

过氧化氢胁迫促进产朊假丝酵母合成谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)在生物细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫时起到非常重要的作用。考察了不同时间不同浓度过氧化氢胁迫和过氧化氢连续胁迫对产朊假丝酵母合成GSH的影响, 发现低浓度过氧化氢的连续胁迫对GSH的合成有明显促进作用。进一步在发酵罐上应用了低浓度过氧化氢(36 mmol/L)持续胁迫策略, 最终GSH产量为922 mg/L, 胞内GSH含量为1.64%, 比对照分别提高了7%和35%。     

产朊假丝酵母利用不同有机酸作碳源的研究

分别通过不同有机酸为惟一碳源,研究了产朊假丝酵母（Candida utilis）能够利用的有机酸的种类,旨在为微生物的基础研究和应用基础研究提供部分依据。分别通过对培养时间和菌体在不同有机酸合成培养基中OD值进行统计分析,发现培养时间和柠檬酸、乳酸、琥珀酸、L-苹果酸培养基的OD值极显著相关（P〈0.01）;培养时间和乙酸、酒石酸、富马酸和草酸培养基的OD值无相关性。通过对比菌体培养前后有机酸合成培养基pH值的变化发现乙酸、酒石酸、富马酸和草酸合成培养基的pH值没有明显变化,而苹果酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸为碳源的合成培养基的pH值均明显增大。从而说明产朊假丝酵母能利用L-苹果酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸为碳源,而不能利用乙酸、酒石酸、草酸、富马酸为碳源。     

产朊假丝酵母细胞壁33 ku蛋白的功能研究

通过胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶对产朊假丝酵母Candida utilis细胞壁的酶解,发现一种分子质量为33 ku的酵母细胞壁主要结构蛋白. 研究显示,在细胞壁上这种蛋白质与细胞壁绝大多数蛋白质成分不同, 它不被胰蛋白酶水解,但对枯草杆菌蛋白酶的作用敏感.33 ku蛋白存在于酵母菌整个对数生长期的细胞壁中,特别是在对数早期细胞壁中,它是唯一的对胰蛋白酶作用不敏感的蛋白质成分.实验证明,该蛋白质对维系酵母细胞壁骨架成分葡聚糖的相互连接和细胞壁的完整结构,具有重要作用,是一种重要的酵母细胞壁嵌合蛋白.     

氮源及碳氮比对产朊假丝酵母合成谷胱甘肽的影响

研究了N源对产朊假丝酵母细胞生长和谷胱甘肽(GSH)合成的影响。在此基础上,分别以(NH4)2SO4和尿素作为单一N源,摇瓶条件下研究了不同C、N比对GSH发酵的影响。结果发现尿素有利于细胞生长,而(NH4)2SO4更有利于GSH的合成,并且酵母细胞在利用这2种N源合成GSH时,各自具有最佳的C、N比((NH4)2SO4为8.3 mol/mol,尿素为5.6 mol/mol)。最佳C、N比下的GSH分批发酵结果显示,尿素是更合适的N源,最终细胞干质量和GSH产量可以分别达到16.48 g/L和246.4 mg/L。最后分别采用发酵动力学模型和代谢网络分析对该结果产生的原因进行了定量解释。     

假丝酵母尿酸酶形成条件

选出了一株产尿酸酶的产朊候丝酵母(Candida utilis)AS2．117。此菌株尿酸酶形成条件的研究表明：尿酸、黄嘌呤和鸟嘌呤对酶形成起诱导作用;玉米浆对菌株生长和酶形成起十分重要的作用;蔗糖、葡萄塘、D-甘露糖和果糖是酶形成的适合碳源;生物素对酶产生有促进作用;在含有玉米浆培养基中加入无机氮源对产酶无作用,添加有机氮略增加产酶量。尿酸酶形成最适培养基组成为(％)：蔗糖;,玉米浆3,尿酸0．1,蛋白胨0．1,生物素0．05,KCI0．1,NaCl 0.1。最适pH为6．2。在250ml三角瓶中装30ml培养基为最适。在200r／min的旋转摇床上25℃振荡培养21h,在此条件下最终酶活力可达0．6u／ml。     

氧应力在产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽过程中的作用

为了提高产朊假丝酵母合成GSH的能力,采用外界氧应力刺激的方式对细胞进行处理。稳定期之前添加H2O2对细胞生长有抑制作用,但稳定期添加H2O2对GSH的合成有促进作用,当H2O2添加总浓度为30 mmol.L-1时,无论采用一次性添加还是补加策略,都可以提高GSH的合成能力,胞内GSH质量分数提高幅度最大接近于20%,GSH产量最多提高17%。GSH分批发酵结果表明,稳定期补加H2O2对于产朊假丝酵母细胞来说,要比一次性添加H2O2对提高胞内GSH含量并最终增加GSH产量更为有效,该结果为实现氧应力刺激下GSH的过量合成提供了条件。     

培养方式对富硒产朊假丝酵母性能的影响

在摇瓶和5 L发酵罐水平上分别考察亚硒酸钠浓度及其添加方式对高性能(高有机硒含量和高谷胱甘肽含量)富硒产朊假丝酵母制备的影响.结果表明:亚硒酸钠添加质量浓度为15 mg/L时,产朊假丝酵母具有较好的富硒效果,但一次性添加对酵母细胞有较大的毒害作用.采用分批次添加亚硒酸钠的方法获得了较好的制备高性能富硒产朊假丝酵母的培养方式:发酵起始添加L-蛋氨酸10 mmol/L,并在发酵过程的12和15 h分别添加亚硒酸钠10和5 mg/L.在此培养方式下,产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽和有机硒含量分别达到172.3 mg/L和1194 μg/g.     

酿酒酵母和产朊假丝酵母原生质体的形成、再生及属间融合

使用由亚硝基胍诱变所得到的营养缺陷型作为单倍体融合亲株的核基因标记,同时也采用线粒体球红霉素抗性突变株的小菌落形式作为融合亲株的线粒体基因标记。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)两亲株原生质体的制备是用对数生长早期的细胞在蜗牛酶和0.7M KCl及β-巯基乙醇或二巯基苏糖醇的作用下完成的。二者的原生质体的形成率在30—60分钟内达到90—99％。原生质体再生率,酿酒酵母最高为29—35％,产朊假丝酵母为7.5％。两亲株的原生质体在35％PEG(M.W.6,000),10mM CaCl_2条件下被诱导融合。在基础培养基上,长出以营养互补为标记的融合菌株。融合频率为10~(-5)—10~(-6)。试验表明,这些融合菌株具有杂种的性质。其中一株杂合子在同化D-木糖、纤维二糖等的能力上比亲株明显增强。     

一种适用于产朊假丝酵母的基因敲除系统及其在gsh1基因敲除中的应用

报道一种适用于产朊假丝酵母Candida utilis的基因敲除系统,利用该敲除系统获得gsh1基因敲除杂合突变株。根据不同种属酵母菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白质的保守序列,克隆C.utilis SZU 07-01的gsh1基因;以商品化质粒pPICZalpha A为基础,构建gsh1基因的敲除载体pPICZalpha A-kan 3,其中,kan基因的启动子TEF被替换为来自于C.utilis SZU 07-01的GAP启动子(pGAP:kan)。质粒电转化C.utilis,获得gsh1基因敲除杂合突变株C.utilis GSH-6。结合发酵培养得到的数据进行分析,突变株的γ-GCS酶活比出发菌株降低17.5%,GSH合成量降低61%,细胞干重降低18.5%。所构建敲除组件pGAP:kan的成功应用为从分子水平研究C.utilis中谷胱甘肽(GSH)的生理功能提供了一种新借鉴。     

Protein phosphorylation and trehalase activation in Candida utilis

Abstract Candida utilis cells contain a regulatory trehalase enzyme (280 kDa) which can be activated by cAMP-dependent phosphorylation. A 100-fold purification of this enzyme activity results in the enrichment of a protein band of apparent M _r 70 000 as identified by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This component is phosphorylated in vivo under conditions in which trehalase activation occurs in whole cells. It is concluded that the trehalase enzyme might be a tetramer, composed of 4 identical 70-kDa subunits.     

产朊假丝酵母(Candida utilis)基因工程研究进展

产朊假丝酵母是生物安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的微生物,也是一种重要的工业微生物。近20年来,随着分子生物学技术的发展,产朊假丝酵母的基因表达系统和基因工程研究及开发应用取得了显著的进展,使得利用该菌表达多种物质成为可能。本文概述了产朊假丝酵母的生物学特点、外源基因表达系统、基因敲除、遗传转化等方面的研究和应用进展。     

产朊假丝酵母细胞和细胞壁对铜离子吸附条件研究

观察温度和pH 值对产朊假丝酵母细胞与分离纯化的细胞壁对铜离子吸附的影响,探讨细胞壁在酵母吸附重金属离子过程中的作用pH 升高,细胞和细胞壁对铜离子的吸附能力都提高,吸附最适pH 为6-0 。温度升高可提高细胞和细胞壁的吸附能力,最适温度为50 ℃。细胞壁是铜离子吸附的主要部位,细胞壁嵌合蛋白(33 ×103蛋白) 起重要作用。     

产朊假丝酵母细胞壁对铜离子吸附机理研究

比较了产朊假丝酵母细胞与分离纯化的细胞壁对铜离子吸附能力。观察铜离子浓度、温度和pH值对产朊假丝酵母吸附铜离子的影响，探讨细胞壁在酵母吸附重金属离子过程中的作用机理。结果表明，细胞壁是酵母吸附重金属离子的主要部位。细胞壁的蛋白酶酶解实验证明，对胰蛋白酶不敏感的细胞壁嵌合蛋白是铜离子吸附的主要位点。     

Enhanced disruption of Candida utilis using enzymatic pretreatment and high-pressure homogenization

The enhancement of the overall disruption of a native strain of Candida utilis (ATCC 9226) was studied using a combination of two methods, namely, pretreatment in the form of partial enzymatic lysis by Zymolyase followed by mechanical disruption in a Microfluidizer high-pressure homogenizer. The cells were grown in both batch and continuous cultures to examine the effect of specific growth rate on disruption. Cell suspensions ranging in concentration from 7 to 120 g DW/L were disrupted with and without enzymatic pretreatment. For yeast grown in batch culture, final total disruption obtained using the combined protocol approached 95% with four passes at a pressure of 95 MPa, as compared with only 65% disruption using only mechanical homogenization. A modified model was developed to predict the fraction disrupted by the enzymatic pretreatment-mechanical homogenization two-stage process. Predicted disruptions agreed favorably with experimental observations (maximum deviation of 20%) over a wide range of operating conditions. (c) 1994 John Wiley & Sons, Inc.