大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建

目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活,再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。PCR鉴定发生插入突变的菌株,应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖,考查对重组蛋白表达的影响。结果:PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较,突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化,但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。结论:大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株可以用于重组蛋白的表达。     

趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶Fe-SOD在大肠杆菌中的表达及生理活性研究

超氧化物歧化酶(SOD)可以减轻超阳阴离子O2-对细胞的毒害作用,提高菌体的抗氧化能力,从而改善菌株的生理状态.利用PCR技术,将趋磁菌AMB-1的超氧化物歧化酶基因esod克隆至原核表达载体pET-20b(+),并在E coli BL21(DE3)有效表达.重组菌株BL21 (DE3)/(pET-20b-fesod-histag)在0.6 mmol/L IPTG诱导浓度下进行发酵培养,在生长前期2-14 h生长速率优于对照组E.coli BL21(DE3)/(pET-20b).通过亲和层析柱纯化后,重组酶蛋白纯度达电泳均一,超氧化物歧化酶fesod活性最造作用温度为25℃,在25℃和45℃下酶热稳定较好,pH4.2-8.2之间酶活力稳定.趋磁菌AMB-1来源的Fe-SOD作为一种抗氧化酶,在大肠杆菌中的有效表达从一定程度上改善了宿主菌的生长情况.     

常见电子介体对大肠杆菌微生物燃料电池产电性能的影响

采用平板涂布研究电子介体中性红、亚甲基蓝和甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长的抑制情况。通过微生物燃料电池技术(MFC)研究同一浓度下上述电子介体对大肠杆菌BL21(DE3)产电性能的影响。结果表明:甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制最强,中性红对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制作用较弱;添加亚甲基蓝对于大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的提高显著;添加0.06 g/L亚甲基蓝对大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的加强效果最好。     

单核细胞增生李斯特菌LadR蛋白对外排泵MdrL的调控机制研究

研究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)调控子LadR对外排泵MdrL的调控作用及方式。采用同源重组技术构建ladR基因缺失菌株ΔladR;通过实时荧光定量PCR检测mdrL基因在野生株EGD-e和突变株ΔladR中的转录水平;构建重组蛋白表达菌株BL21(DE3)-ladR并纯化重组蛋白His6-LadR;通过凝胶阻滞试验检测LadR蛋白与mdrL基因启动子区域的结合活性。成功构建ladR基因缺失菌株ΔladR。与野生株EGD-e相比,突变株ΔladR中mdrL基因的转录水平提高约51倍;成功构建重组蛋白表达菌株BL21(DE3)-ladR,纯化得到浓度为1 mg/mL的重组蛋白His6-LadR;凝胶阻滞实验结果显示,重组蛋白His6-LadR可与mdrL基因的启动子区域特异性结合。Lm的调控子LadR通过与mdrL基因启动子区域特异性结合实现对外排泵MdrL的负调控。     

易错PCR技术提高黑曲霉N25植酸酶活力的研究

利用易错PCR技术对黑曲霉(Aspergillus niger)N25的植酸酶基因phyA进行定向进化研究,突变基因产物重组于表达载体pET32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,经筛选获得了最佳突变菌株pET32a-phyAep,其植酸酶活力比出发酶提高了41.8%。突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性,最适温度和最适pH值无显著变化。     

象耳豆根结线虫Hsp70基因相关功能分析

Hsp70基因的表达量在研究中常作为一个重要的生理指标来反映机体的状况。为了研究象耳豆根结线虫Hsp70基因相关功能,本研究前期成功构建了p EASY-E1-Me Hsp70和p ET30a-Me Hsp70两个原核表达载体,通过热激转化将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21进行表达。对转入Me Hsp70基因的大场杆菌BL21、转入空载的大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21原始菌种在55℃、65℃进行热稳定性测定,在37℃、200 r/min条件下进行生长曲线测定。热稳定性试验结果表明,转入p ET30a-Me Hsp70基因的大场杆菌生存时间较长,而转入p EASY-E1-Me Hsp70的菌株、转入空载的菌株和原始菌株热稳定性都相对较差。通过荧光定量PCR测定发现Me Hsp70基因均有上调表达,转入p ET30a-Me Hsp70基因的大场杆菌Hsp70基因水平高于其他菌株。生长曲线测定试验结果表明,重组菌株与原始菌株生长曲线基本一致,转入p ET30a-Me Hsp70载体的菌株调整期滞留时间长于其他菌株。该项研究表明Me Hsp70基因能够提升大肠杆菌BL21的抗应激能力和影响大肠杆菌BL21的生长,为进一步开展Me Hsp70基因在象耳豆根结线虫生长过程的功能研究提供了一定的理论基础。     

大肠杆菌甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)的敲除及其对甘油产量的影响

利用Red重组系统构建了大肠杆菌JM109甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)缺失的双突变菌株JM109B,然后将表达酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1)和3-磷酸甘油酯酶基因(HOR2)的质粒pSE-gpd1-hor2转化到JM109B突变菌株中,在含1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中37℃发酵24 h,甘油的最高产量为5.61 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍;在30 L发酵罐中发酵28 h,甘油的最高产量为103.12 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍,是原始菌株BL21/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.41倍,葡萄糖转化率为50.39%。     

枯草杆菌manA基因的克隆及定点突变

manA是编码β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC3.2.1.78)的基因。将枯草杆菌A33株的manA基因插入到pET-32a载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源非融合表达,表达活力为41.58U/mL。为了提高酶的表达活力,当采用PCR介导的定点突变技术将该基因第2号密码子CUU突变为GUU,构建成突变表达载体pET-32a-manA*并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,目标酶表达活力增加到138.65U/mL。说明当β-甘露聚糖酶N端第二号氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸后,酶在大肠杆菌中的表达活力大大提高。推测是由于突变后的β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的稳定性增强所致。突变表达的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH值并没有发生明显改变。     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型O2:K89)Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH::Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株.A2△fimH的正确构建.通过fimH基因互补试验使A2△fimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性.红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象.体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株.禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础.     

大肠杆菌rhtA缺失对血红素合成的影响

【背景】Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程的常用宿主,以C5途径合成5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinicacid,ALA),ALA是合成血红素的重要前体物质,但ALA分泌对血红素合成的影响尚不清楚。【目的】阐明参与ALA外运的RhtA在血红素合成途径中的作用。【方法】利用Red同源重组,敲除Escherichia coli BL21(DE3)的rhtA,同时构建重组质粒pEA过表达血红素合成途径中的关键酶基因hemA,检测分析血红素及其前体物质含量,以及血红素合成途径中10个关键基因的表达水平。【结果】敲除rhtA对菌体生长没有显著影响,敲除菌株BL21(DE3)Δrht A与原始菌株BL21(DE3)比较,ALA的胞外含量下降23%,血红素含量提高12%,尿卟啉III (Uroporphyrin III,UIII)、粪卟啉III (Coproporphyrin III,CIII)和原卟啉IX (Protoporphyrin IX,PPIX)的含量分别提高25%、15%和18%;敲除rhtA同时过表达hemA的菌株BL21(DE3)ΔrhtA/pEA与仅过表达hemA的菌株BL21(DE3)/pEA比较,胞外ALA减少了16%,血红素含量提高了24%,UIII和CIII含量分别提高55%和64%,PPIX含量显著增加,约为4.7倍。实时定量PCR结果表明,rhtA缺失后,hemC基因转录水平下调,其余9个基因转录水平均有不同程度的上调。【结论】rhtA敲除减少了ALA的外运,使得胞内血红素产量得到提高。     

具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白TCSYFF-KR的构建及原核表达

目的：构建具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白（TCS）,并将其在原核系统内进行表达与纯化。方法：借助计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇（YFF81-83和KR173-174）,并依此设计适当的突变引物;以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增双突变型TCS全长基因,经BamHI和EcoRI双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western印迹鉴定;用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变型TCS蛋白进行纯化。结果：构建了突变型TCSYFY-KR,并获得了该蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化,产生大量均一的突变型TCS蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了一条新途径。     

人角质细胞生长因子2在不同原核表达系统中的表达差异

目的:比较重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性之间的差异。方法:利用PCR方法从人胚胎肺成纤维细胞cDNA扩增得到hKGF-2序列,双酶切后分别克隆到pBV220、pQE31和pET-24b载体中,分别转化大肠杆菌JM109、M15和BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE分析rhKGF-2的表达量和表达稳定性,并纯化rhKGF-2。结果:pBV220-rhKGF-2与pET-24b-rhKGF-2在宿主菌内经诱导后均有目的蛋白表达,其中pBV220-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的10%,pET-24b-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的25%,且均为可溶性表达,但后者的表达稳定性明显优于前者,而pQE31-rhKGF-2在宿主菌内几乎没有表达。结论:hKGF-2在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性存在明显差异。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌RNaseⅢ基因的克隆与表达

目的：克隆并在原核表达系统中表达RNaseⅢ基因。方法：提取大肠杆菌JM109株的基因组DNA,以之为模板扩增得到RNaseⅢ基因全序列,将该编码序列克隆到原核表达载体pET-22b（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组RNaseⅢ表达。结果与结论：在大肠杆菌中克隆到了RNaseⅢ的全基因,经测序证明与数据库中报道的序列一致;表达的重组RNaseⅢ主要以包涵体形式存在。     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达、纯化及酶学性质研究

本研究的钝齿棒杆菌(Gorynebacterium crenatum SYPA)是筛选得到的高产精氨酸突变菌株,其中argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶(NAGK)是精氨酸合成过程中的关键酶。为了进一步研究该酶的相关特性,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA)基因组为模板,扩增得到其arB基因,成功构建了pET-28a-argB重组质粒,并在E.coli BL21(DE3)中诱导后高效表达。利用载体pET-28a上的His6·Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的NAGK,纯化后酶的比活力达到7.28 U/mg,纯化倍数达66.18。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,该酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为9.0;酶学动力学参数以N-乙酰谷氨酸为底物的Km为3.35mmol/L;金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、螯合剂对乙酰谷氨酸激酶均有明显的抑制作用。     

白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪酶Ⅰ基因lip1,将该基因与原核表达质粒载体pET-22b（＋）连接,构建重组质粒pETl-ip1,转化E.coliBL21（DE3）,酶切鉴定,筛选得到重组菌。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺（SDS-PAGE）显示重组脂肪酶Ⅰ的相对分子质量约为5.8×10^4,酶活为2.73 U/mL,表明lip1基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因lip1能够在大肠杆菌中有效地表达。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化

目的：利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法：将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果：①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论：在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...