糖的高效液相色谱分析研究 Ⅱ.木糖及若干β1→4低聚木糖的快速分离和测定

本文报告木糖和若干β-1→4低聚木糖的高效液相色谱,固定相分别采用国产氨基结合键固定相YWG-NH_2和进口氨基结合键固定相AMINO-SIL-X-1,流动相为乙腈-水(70:30),以示差折射检定器,在10分钟之内能快速和定量测定低聚木糖,它们是木二糖(X_2)、木三糖(X_3)、木四糖(X_4)、木五糖(X_5)、木六糖(X_6)和木七糖(X_7)。最小检测量为4nmol。其容量因子K′的对数值logK′与低聚糖的聚合度DP呈良好的线性关系。     

白地霉的戊糖代谢——Ⅰ.木糖代谢的初步变化途径

(1)用在木糖上培养的白地霉2.361无細胞提取液进行了木糖代謝酶体系的研究。查明木糖代謝的初步变化途径如下: D-木糖 TPNH H~ →木糖还原酶←木糖醇 TPN~ (1) 木糖醇 DPN~ →木糖醇脫氫酶←D-木酮糖 DPNH H~ (2) D-木酮糖 ATP→D-木酮糖激酶D-木酮糖-5-磷酸(3) (2)催化式(1)的酶为木糖还原酶,需要TPN。用紙层析法鉴定木糖还原的产物为木糖醇。(3)催化式(2)的酶称木糖醇脫氫酶,需DPN。(4)催化式(3)的酶为D-木酮糖激酶,所試过的其他戊糖在同样条件下均不被磷酸化。(5)白地霉无細胞提取液中测不出木糖(?)构酶的活力。排除了这一途径的可能性。(6)催化式(1)(2)(3)各反应的酶均有适应形成的特性,符合Stanier的連續适应学說。     

高效液相色谱法检测发酵液中木糖和木糖醇

建立高效液相色谱检测发酵液中木糖和木糖醇含量的分析方法。色谱柱为HypersilNH2 柱 (4 .6mmi.d.× 2 5 0mm ,5 μm) ,柱温 3 5℃ ,流动相为乙腈—水 (80∶2 0 ) ,流速 1 .0mL .min 1,示差折光检测器检测。木糖和木糖醇在 3 .0～ 60mg.mL 1范围内 ,峰面积与其浓度线性关系良好 (г=0 .9995 ) ;平均回收率分别为 96.0 7% (n =5 ,RSD =0 .5 1 % )和 97.47% (n =5 ,RSD =1 .1 3 % )。方法简便、快速、准确。     

β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能研究进展

β-木糖苷酶是木聚糖酶酶系的一种酶,其功能主要是降解半纤维素中最常见及含量最高的组分——木聚糖。近些年,研究人员发现一些微生物来源的β-木糖苷酶具有生物活性物质转化功能,可通过转糖基作用形成带有木糖基的生物活性物质,也可通过水解作用将带有木糖基的物质,如三七皂苷R1和R2、黄芪甲苷IV (astragaloside IV,ASI)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetyltaxol,XDT)和花青素转化为生物活性物质,因此,这些β-木糖苷酶在食品和医药等领域具有巨大的潜在应用价值。此外,研究人员揭示了β-木糖苷酶在生物活性物质转化功能方面的一些机制。本文主要介绍了β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能、酶来源、家族分类、转化机制及应用,以期为β-木糖苷酶的进一步开发利用提供参考。     

4种蜘蛛染色体研究初报

以早期胚胎细胞为材料,经秋水仙素处理、低渗、固定,制片及染色,制备蜘蛛体细胞染色体标本,并用血细胞染色体制片观察验证,镜检表明,4科4种蜘蛛的体细胞染色体数为:中华涡蛛(Oatonooa sinensis)为17和18,居室拟壁钱(Oecobius cellarioum)为22和24;北国壁钱(Uroctea lesserti)为39和42:大腹圆蛛(Aranea Ventricosus)为49和52。计数结果分析,它们的性别决定染色体机制是:中华涡蛛为XO型,居室拟壁钱为X_1X_2O型,北国壁钱为X_1X_2X_3O型,大腹圆蛛为X_1X_2X_3O型。     

高效液相色谱法同时测定保健食品中低聚果糖和低聚木糖

目的 建立高效液相色谱法同时测定保健食品中低聚果糖(包括蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖)和低聚木糖（包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖及木七糖）的含量。方法 采用键合有酰胺官能团杂化填料的色谱柱,以乙腈和水为流动相,利用亲水保留色谱机制（HILIC）实现对低聚果糖和低聚木糖各单体的有效分离,结合示差检测以外标法定量。该方法同时利用木糖对低聚木糖各单体转换系数进行定量。结果 低聚果糖和低聚木糖各单体线性关系良好,相关系数均大于0.998,平均加标回收率为95%以上,具有较高的准确度和良好的重现性。结论 高效液相色谱法由于采用木糖对照品转换定量低聚木糖含量,减少低聚木糖各单体标准品在日常工作中的使用量,进而降低检测成本。该方法经济可靠,测定结果准确,适合于添加有低聚果糖和低聚木糖的功能性产品检测。     

黑曲霉β-木糖苷酶An-xyl的重组表达与木糖耐受性表征

木糖苷酶催化低聚木糖水解在木质纤维素降解中起重要作用,但该酶活性易被产物木糖抑制,严重限制了其应用。基于分子对接,本文研究了茶梗发酵培养基差异表达显著的黑曲霉(Aspergillus niger) β-木糖苷酶An-xyl与木糖的亲和性,并对其进行克隆表达和性质表征,进一步探讨了该酶与纤维素酶对茶梗中木质纤维素的降解作用。分子对接结果表明,An-xyl与木糖的亲和性低于木糖耐受性较差的米曲霉β-木糖苷酶xyl A。重组表达的An-xyl木糖抑制常数Ki值为433.2 mmol/L,与同为GH3家族的β-木糖苷酶相比木糖耐受性较高。以p NPX为底物时,Km和Vmax分别为3.6 mmol/L和10 000μmol/(min·mL)。An-xyl最适温度65°C,最适pH 4.0,65°C处理300 min能保持约61%的酶活力,在pH2.0-8.0的范围内处理24h后酶活力仍能维持80%左右。添加An-xyl与纤维素酶共同水解茶梗,反应2h和4h产生还原糖含量比单独使用纤维素酶水解分别提高了19.3%和38.6%。本研究表明,通过差异表达挖掘的An-xyl具有高木糖耐受性和较好的催化活...     

HPLC测定葛花中6″-O-木糖鸢尾苷的含量

本文建立了葛花中6″-O-木糖鸢尾苷含量测定的HPLC方法。采用GRACE C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,紫外检测波长为265 nm,柱温为室温。6″-O-木糖鸢尾苷的峰面积(Y)与浓度(X)在10.33～185.99μg/mL范围内线性关系良好,Y=30731X–216635,r=0.9992(n=7);平均回收率为100.2%,RSD<2%(n=9);测得8批葛花药材中6″-O-木糖鸢尾苷含量为11.08～48.23 mg/g。方法学验证结果表明该法准确、可靠,可用于葛花中主要成分6″-O-木糖鸢尾苷的含量测定。     

糖的高效液相色谱分析研究——Ⅰ.中性糖、氨基糖和双糖的分析

本文报道常见的中性糖(包括醛糖、酮糖和脱氧糖)、氨基糖和双糖在氨基结合键固定相色谱柱上,以不同比例的乙腈-水和乙腈-水-甲醇体系作流动相时的高效液相色谱行为,测定了它们的保留时间和_R 和容量因子K'以及它们的定量方法,并对这些结果进行了讨论。     

糖的高效液相色谱分析研究 Ⅰ.中性糖、氨基糖和双糖的分析

本文报道常见的中性糖(包括醛糖、酮糖和脱氧糖)、氨基糖和双糖在氨基结合键固定相色谱柱上,以不同比例的乙腈-水和乙腈-水-甲醇体系作流动相时的高效液相色谱行为,测定了它们的保留时间t_R和容量因子K′以及它们的定量方法,并对这些结果进行了讨论。     

葡萄糖和木糖双底物生物转化生产2,3-丁二醇和氢气的代谢计量分析

以Klebsiella pneumoniae利用葡萄糖和木糖双底物生物转化生产2,3-丁二醇和氢气过程为研究对象,对其进行代谢计量分析。分析结果显示:2,3-丁二醇和氢气相对于底物葡萄糖和木糖的质量收率依赖于还原能力NADH2氧化磷酸化的分率(δ)。当δ=27时,即在总还原能力NADH2中有27mol NADH2被氧化磷酸化,剩余部分用来产生氢气,呼吸商为14时,2,3-丁二醇和氢气的最优质量收率分别为50%和0.8%;而当δ=1,即还原能力NADH2全部被氧化磷酸化、不产生氢气,呼吸商为4时,2,3-丁二醇的质量收率为37.5%;2,3-丁二醇和氢气的质量收率与底物中葡萄糖和木糖的比值无关。而氢气的摩尔收率与底物中葡萄糖和木糖的比值相关,当底物全部是葡萄糖或木糖时,其最优摩尔收率分别为71%和60%。该分析结果为葡萄糖和木糖双底物生物转化生产2,3-丁二醇过程的实验研究奠定了理论基础。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

海枣曲霉β-木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中。通过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双水相分离．相继用SephadexG-100凝胶过滤、DEAE—Sephadex A-50离子交换柱层析、羟基磷灰石吸附层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、SE—Sephadex C-50离子交换层析以及Sephadex G-50柱层析等提纯步骤,提纯到凝胶电泳均一的β-木糖苷酶。该酶的最适pH为3．5,最适温度为65 C．在pH3．5—6．5之间稳定,酶保温30分钟时的半失活温度(t1-2)为68C。酶的分子量勾95 000,等电点为4．4。Hg2-和Ag+对该酶有强烈的抑制作用。在所测定的底物中．Β-术糖苷酶仅对β-木精苷(pNP-β-Xyl)有强水解作用。其Km值为0．63mmol／L．Vmax为410 umol·min 1．Mg-1。D-木糖为β-木糖苷酶的竞争性抑制剂,其K．值为7．5mmol／L。     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

一株海洋微藻的鉴定及其原生质体制备条件优化

从烟台海滨水域分离出一株海洋单细胞微藻。通过形态学鉴定和18S r DNA基因序列分析确定该株真核微藻属于四爿藻属(Tetraselmis sp.),命名为138号藻种。利用Central Composite法的Box-Behnken实验设计优化了此藻株的原生质体备条件。获得了以原生质体制备率为目标函数的三元二次回归方程:Y_1=88. 30-0. 19X_1+2. 44X_2+2. 28X_3-0. 95X_1X_2-3. 13X_1X_3+3. 78X_2X_3-9. 85X_1~2-7. 95X_2~2-7. 22X_3~2。得到最优制备条件:混合酶比例纤维素酶∶果胶酶为5∶2;混合酶浓度为4. 5%(纤维素酶浓度为2. 7%,果胶酶浓度为1. 8%);缓冲液pH为6. 4,最高理论制备率81. 5%。经过3次平行试验,实际得到的原生质体制备率为80. 5%,与模型预测值的误差为1. 24%。绿色荧光蛋白报告基因瞬时表达检测了所制备原生质体的转化能力。     

基于与木糖进行美拉德反应的低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能研究

研究低聚壳聚糖与木糖的美拉德反应,考察了两种体系(低聚壳聚糖与木糖的质量比分别为1∶1和1∶3)反应过程中pH、吸光度及荧光值的变化,醇沉法提取4 h和8 h的低聚壳聚糖美拉德反应衍生物,分别为CX11-4、CX13-4、CX11-8和CX13-8。对衍生物进行红外表征和分子量测定,并研究其对羟基自由基.OH和DPPH的清除能力以及还原能力。结果显示:壳聚糖衍生物的抗氧化能力都明显优于低聚壳聚糖,抗氧化活性顺序为CX13-4>CX11-4,CX11-8>CX13-8。可见,壳聚糖美拉德衍生物的抗氧化活性不仅与反应物的比例有关,还与反应的时间有关。     

7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2活性中心预测及初步的功能分析

7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2是克隆自真菌香菇的两个双功能酶(序列一致性97%),具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶双重活性,能特异性地水解移除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等紫杉烷上的木糖基。采用生物信息学方法对两个酶蛋白进行酶活性中心预测,初步确定Asp300和Glu529分别为亲核试剂和一般酸/碱催化剂,而Asn172-Gly173-Arg174和Lys207-His208为底物结合结构域。以LXYL-P1-2为研究对象,以毕赤酵母细胞为表达宿主,应用定点突变技术获得了N172A、G173A、R174A、K207A、H208A、D300N和E529Q突变体,并进行了酶活性分析。结果显示:在分别以PNP-Xyl、PNP-Glc和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为底物时,N172A、G173A、R174A、K207A、D300N和E529Q的β-木糖苷酶与β-葡萄糖苷酶活性大幅度下降甚至完全消失;H208A的β-木糖苷酶活性也显著下降,但仍保持98%的β-葡萄糖苷酶活性。其结果初步验证了对上述两个酶蛋白的活性中心的预测,为进一步揭示7-木糖紫杉烷糖基水解酶结构与功能的关系提供了实验依据。     

皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖/木糖的糖转运动力学

皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)能够同步利用葡萄糖和木糖生产油脂。以2-脱氧葡萄糖(2-DOG)为底物,考察皮状丝孢酵母糖跨膜运输的转运动力学。结果表明:2-DOG转运符合米氏方程,表观米氏常数K m为0.19 mmol/L,最大转运速率V max为14.1 nmol/(min·mg)。葡萄糖和木糖均竞争性抑制2-DOG转运,葡萄糖表观抑制常数K i远低于木糖,表明存在一个共用转运体系,且该转运体系对葡萄糖亲和力更高。大量木糖与2-DOG同时转运到胞内,进一步说明木糖与葡萄糖共运输。代谢抑制剂和pH对糖转运有明显影响,说明质子/底物同向运输系统是该酵母的主要糖转运系统。     

转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能

【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。     

不同光周期条件下谷子农艺性状的光周期敏感性评价

本研究连续2年在海南和洛阳两个不同日照长度的生态区调查了156份谷子材料的株高、叶片数、抽穗期、穗长、穗粗、穗码数、码粒数、穗粒重、千粒重9个主要农艺性状,通过9个性状的相对光周期敏感度比较分析、构建光周期敏感性综合评价指标D值对各性状进行回归分析两种方法评价9个性状的光周期敏感性,筛选能够准确反映谷子光周期敏感性的指标性状,为开展谷子光周期敏感性遗传学分析、光周期敏感性相关基因的定位奠定基础。结果表明:光周期相对敏感度排列顺序为:穗码数抽穗期穗长株高叶片数穗粒重;各个农艺性状对光周期敏感综合指标D的回归方程为D=-8.803×10-18+0.187X_1+0.041X_2+0.146X_3+0.202X_4+0.130X_5+0.081X_6+0.098X_7-0.086X_8+0.126X_9,其中X_1、X_2、X_3、X_4、X_5、X_6、X_7、X_8、X_9分别代表抽穗期、穗粒重、株高、叶片数、穗长、穗粗、穗码数、码粒数、千粒重。9个农艺性状对光周期敏感综合指标D的直接作用最大的是穗码数(0.395),其次是穗长(0.239)、抽穗期(0.228)、穗粒重(0.176)、叶片数(0.164)、株高(0.144)。结合各个农艺性状的相对敏感度比较分析结果以及各农艺性状对综合指标D的回归分析结果,得出穗码数、穗长、抽穗期3个性状为谷子光周期极敏感指标,叶片数光周期敏感度较弱,可以作为谷子光周期敏感性评价的次要指标,株高、穗粒重在两种评价方法中排序差异较大,稳定性差,不适合作为谷子光周期敏感性评价指标。