Smads基因功能的研究进展

转化生长因子 -β( TGF-β)超家族通过调节细胞的增殖、分化、移行和凋亡而在脊椎动物发育过程中起重要的作用 . SMAD家族是一类新发现的 TGF-β信号的细胞质内介导者 ,它们可将TGF- β信号直接从细胞膜转导入细胞核内 .受体激活的 SMADs被特导性的细胞表面受体磷酸化后 ,与通用介导分子 SMAD4相互作用形成异源三聚体 ,转移至细胞核内并激活靶基因的转录 .抑制型 SMADs通过负反馈途径阻断或减弱 TGF- β信号 .SMADs通过与 TGF- β配体应答的启动子序列及其它转录因子和辅助活化因子相互作用而调节转录 .通过同源重组在小鼠中定位敲除Smads基因的研究已经开始揭示 SMADs分子在脊椎动物发育过程中的功能 .     

Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用.培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Western blot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异.结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显受到抑制.表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.     

转染Smad7基因的人Tenon囊成纤维细胞Smad2及Ⅰ型胶原蛋白表达的改变(简报)

大量研究表明,TGF-β作为一种具有多种功能的生长因子,是全身瘢痕愈合的重要刺激因素.在人眼部参与多种眼部纤维化的过程。尤其在促进青光眼滤过术后结膜瘢痕形成中起重要作用。Smad蛋白家族在TGF-β超家族的信号转导中具有重要的作用。Smad7主要通过抑制TGF书受体介导的Smad2、Smad3磷酸化来拮抗TGF-β的信号转导,被认为是TGF-β超家族信号转导自我调节的一种负反馈信号。     

文昌鱼AmphiSmad 1／5／8和AmphiSmad4的克隆和表达

Smad蛋白是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员细胞内信号传导蛋白。本研究在青岛文昌鱼中克隆到了两个Smad基因,分别命名为AmphiSmad1／5／8和AmphiSmad4。它们编码的氨基酸序列具有典型的Smad家族蛋白的结构特征,都包含保守的MH1和MH2结构域。进化分析表明,AmphiSmad1／5／8属于R-Smad亚家族的Smad1,Smad5和Smad8亚群。而AmphiSmad4属于Co-Smad亚家族。在文昌鱼的早期胚胎发育中,这两个基因都在脊索、肌节和消化道壁表达,呈腹部化表达模式,推测可能参与文昌鱼背腹轴的形成和分化。另外,在正常文昌鱼成体中这两个基因也在所检测的组织中广泛表达,尤其在脊索和性腺中高表达,提示它们可能在器官的形成中发挥重要作用。     

Smad7基因对胞外信号调节激酶磷酸化水平的调控

研究在BEP2D细胞中,作为Smads蛋白家族的抑制分子,Smad7对胞外信号调节的蛋白激酶(ERK1／2或p44／42)磷酸化水平的调控。将Smad7真核表达载体或人工合成的Smad7-siRNA转染BEP2D细胞,TGF—β刺激,通过Western印迹检测Smad7对p44／42蛋白磷酸化的影响。结果在永生化BEP2D细胞中,TGF-β1刺激后5min开始,可以检测到磷酸化的p44／42;到60min达到高峰,之后逐渐降低。细胞转染Smad7,TGF-β作用60rain后,p44／42磷酸化水平明显增高;而转染Smad7-SiRNA,TGF-β作用60min后,p44／42磷酸化水平显降低。p44／42蛋白水平基本上不受TGF—β1刺激及Smad7表达水平的影响。以上结果说明,在BEP2D细胞中,Smad7可参与TGF—β对ERK／MAPK通路的活化作用。     

血管平滑肌细胞中ERK通路与TGF-β_1/Smad通路的相互作用

目的:探讨血管平滑肌细胞(VSMC)中TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系。方法:原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,分四组:①对照组,②TGF-β1组,③ERK阻断剂(PD98059)组和④TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。分别用Western blot法检测VSMC内Smad2/3、ERK1/2蛋白表达及磷酸化Smad2/3、磷酸化ERK1/2蛋白含量,RT-PCR方法测VSMC中Smad2、Smad3mRNA的表达。结果:①与对照组相比,TGF-β1组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量增多(P0.05),ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05),TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量无差异;与TGF-β1组相比,TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无差异。②各组的Smad2、Smad3mRNA表达无差异。结论:TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA表达水平无影响。     

Smad4分子在ERK/MAPK信号转导通路中的作用

为了探讨在人永生化支气管上皮细胞BEP2D细胞中,Smad4分子对 ERK/MAPK通路的作用,我们用RNA干扰的方法分别设计了两对Smad4 siRNA,并使BEP2D细胞中Smad4靶向沉默,用Western印迹分析了细胞内ERK激酶和MEK激酶磷酸化水平的变化.结果发现,当Smad4表达沉默后,ERK激酶磷酸化水平未变,MEK激酶磷酸化水平有所降低;再加TGF-β1诱导后ERK激酶和MEK激酶磷酸化水平均显著降低至基础水平以下.结果表明在BEP2D细胞中,Smad4的缺失抑制TGF-β1对ERK/MAPK通路的活化,故提出TGF β活化ERK/MAPK通路需要Smad4存在的假设.     

TGF-β/Smad信号通路在肾小球硬化模型中表达的意义

目的:通过观察在肾小球硬化动物模型中TGF-β、Smad2和Smad7蛋白和mRNA表达的意义,了解TGF-β/Smads信号通路在肾小球硬化中的作用.方法:制备肾小球硬化动物模型,检测24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及血尿素氮水平,观察肾组织形态学改变;免疫组织化学检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白水平;荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的水平结果:TGFβ1、Smad2和Smad7正常情况下普遍在肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达;模型组4周时TGFβ1和Smad2蛋白表达增加,Smad7蛋白表达下降;6～8周时TGF-β1和Smad2蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达明显下降.模型组4周时TGF-β1和Smad2 mRNA出现表达上调,6～8周TGF-β1和Smad2 mRNA表达明显增加.4周时Smad7 mRNA表达下调,6～8周Smad7 mRNA表达明显下降.模型组与对照组比较有显著性差异(p＜0.01).结论:TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球硬化的纤维化进程,Smad7是TGF-β/Smad信号通路抑制性调控因子,可能为治疗肾小球硬化提供治疗手段.     

TGF-β1以受体和Smad7依赖的方式活化ERK

目的:探讨人永生化BEP2D细胞中TGF-β活化ERK/MAPK通路的机制。方法:用RNA干扰的方法设计siRNAs使人永生化BEP2D细胞中TβRⅡ、Smad7基因沉默,用Westernblot分析TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化的变化。结果:当Smad7表达沉默后,TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化水平显著降低;当TβRⅡ和Smad7表达同时发生沉默后,细胞内TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化水平进一步降低到基础水平以下。结论:TGF-β1以受体和Smad7依赖的方式活化ERK/MAPK通路。     

利用四环素调控系统研究 CHIP 对TGF-β信号通路的抑制性调节

为了研究伴侣分子相互作用蛋白 CHIP 对 TGF-β信号通路的调控,利用四环素基因表达调控系统,建立四环素调控表达 CHIP 的稳定细胞系 (Mv1Lu-Tet off-CHIP). 利用此细胞模型,发现 CHIP 的过量表达可显著降低细胞内 Smad2/3 蛋白水平;荧光素酶报告分析也表明开启 CHIP 蛋白表达可明显降低 Smads 介导的基因转录活性;进一步的免疫印迹结果显示 CHIP 蛋白可明显下调 TGF-β所诱导的下游基因 JunB 的表达 . 上述结果提示 CHIP 可以作为一种新的蛋白质分子抑制性调节 TGF-β信号通路 .     

转化生长因子β1对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游Smad3信号蛋白在大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法：TGF-β1干预培养新生大鼠心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量。结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型,在不同时间点处死动物,检测左室质量指数（LVM1）,RT—PCR检测TGF-β1及Smad3的mRNA表达,Westernblot检测Smad3蛋白的表达。结果：不同剂量TGF-β1均能明显增加体外培养的心肌细胞总蛋白含量,TGF-β1（3ng／ml）还增加心肌细胞Smad3 mRNA和蛋白的表达,其表达量1h达高峰,持续至TGF-β1刺激后8h。大鼠腹主动脉结扎术后3d LVMI开始上升并持续至术后28d,心肌组织中TGF-β1、Smad3的mRNA表达水平以及Smad3蛋白表达术后3d也开始上升持续至术后28d,术后14d为表达高峰（P〈0．01）。结论：TGF-β1能诱导大鼠心肌细胞肥大,其信号蛋白Smad3参与了大鼠心肌肥大的病理过程。     

Smad4介导转化生长因子-β信号调节骨骼发育和稳态维持的功能

转化生长因子-β（TGF-β）是一个包括数十种TGF-βs、骨形态发生蛋白（BMPs）等配体在内的生长因子超家族,在哺乳动物整体和组织器官发育过程中具有广泛而重要的功能。Smad4是细胞内TGF-β信号通路的核心信号转导分子。为了深入研究Smad4介导的TGF-β信号在骨骼发育过程中的生理功能,我们利用转基因技术研制了软骨细胞、肥大型软骨细胞和成骨细胞分别特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,利用条件基因敲除技术研制了不同类型骨骼细胞Smad4基因敲除的小鼠模型。表型分析结果揭示了Smad4在软骨细胞增殖和分化、骨重塑以及稳态维持过程中的功能以及相关的分子机制,为理解人类相关骨骼疾病的发生及其机理提供了新的线索。     

神经酰胺转运蛋白在非囊泡转运中的作用机制

神经酰胺转运蛋白（ceramide transfer protein,CERT）是介导神经酰胺（ceramide）非囊泡转运的载体.它包括3个功能区域： PH、FFAT和START.PH和FFAT分别发挥高尔基体和内质网的靶向作用,羧基端的START主要用于与神经酰胺结合.CERT的转运受多种因素的调节,依赖于PKD和PP2Cε诱导的丝氨酸重复区域（SR）的磷酸化和去磷酸化,氧化应激刺激的CERT三聚体形成,以及PI4KⅢβ催化的高尔基体接头PI4P的生成等.CERT功能障碍会导致细胞易受氧化应激的损害.本文拟从CERT的结构、作用及其调节机制3方面进行综述,揭示CERT的研究进展.     

Smads转录激活检测系统的建立

目的:构建Smads转录激活检测系统,以研究Smad2、Smad3、Smad4的功能。方法:将Smad2/3/4编码序列以正确读码框与pRC-lac载体中的Lac阻遏蛋白编码序列融合构建重组质粒,将重组质粒与受Lac操纵子调控的荧光素酶报告基因质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,其活性的强弱即代表转录活性的强弱。结果:Smad2和Smad3具有较强的依赖于TGF-β1的转录活性;Smad4全长没有检测到转录活性,但其SAD结构域有不依赖于TGF-β1的转录活性,MH2结构域有依赖于TGF-β1的转录活性。结论:构建的Smads转录激活检测系统能有效地用于Smad2、Smad3、Smad4功能的研究。     

糖尿病大鼠血糖控制前后肾小管上皮细胞VEGF、TGF-β1及Smad蛋白表达的动态研究

目的动态观察链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠血糖控制前后肾小管上皮细胞（TEC）中血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、Smad4的表达情况,探讨四者在糖尿病大鼠TEC表型转变和肾间质纤维化中可能发挥的作用及相互关系。方法实验动物随机分为5组,依病程长短分为①A组（2周组）,②B组（4周组）,③C组（8周组）,④D组（16周组）,⑤E组（24周组）,每组分别设有正常对照组（N组）和糖尿病组（a组）;另外,16周、24周两组加设胰岛素治疗组（b组）。采用尾静脉注射STZ法复制糖尿病大鼠模型;免疫组织化学方法检测肾小管VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4及α-平滑肌肌动蛋白（-αSMA）和纤连蛋白（FN）的表达;Western blot检测肾皮质VEGF和TGF-β1蛋白;PAS染色光镜观察肾小管基底膜变化及细胞外基质沉积情况等形态学改变;生化方法测定血糖、血肌酐及24小时尿蛋白量。结果正常对照组VEGF、TGF-β1及Smad2/3、Smad4在肾小管均有少量表达,-αSMA在肾小管无表达;糖尿病组肾小管前述四者的表达均显著高于正常对照组,且从16周开始肾小管上皮细胞可见α-SMA蛋白阳性表达;糖尿病16周时肾小管VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4两两之间呈正相关;随糖尿病进展,α-SMA及FN在肾小管表达增多,24h尿蛋白增多,肾脏肥大指数增大,而VEGF、TGF-β1二者都分别和-αSMA、FN、24h尿蛋白及肾脏肥大指数呈正相关性;胰岛素治疗后,VEGF、TGF-β1、Smad2/3、Smad4及FN的表达都比糖尿病组明显下降,且各指标之间的正相关性依然存在,-αSMA蛋白则呈阴性表达。结论糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞表达的VEGF、TGF-β1及Smad2/3、Smad4参与了TEC表型转变和肾间质纤维化的发生,并且VEGF和TGF-β1相互作用,共同促进了肾脏损害。胰岛素对DN大鼠TEMT和肾间质纤维化的影响可能部分是通过间接阻断VEGF、TGF-β1和Smad2/3、Smad4在TEC中的合成来实现的。     

SMAD介导的TGF—β信号转导与大肠癌

转化生长因子β（TGF－β）家族成员与各自的膜受体（Ⅰ型及Ⅱ型受体）结合后,通路限制性SMADs被磷酸化,并与共介导Smad4形成杂聚体而转位至细胞核,从而调节一些靶基因的转录而对TGF－β产生反应,抑制性SMADs对此过程有负性调节作用,由SMADs介导的TGF－β信号转导通路的异常在大肠癌的发生发展中发挥重要作用,主要包括膜受体,通路限制性SMADs和共介导Smad4的改变,而抑制SMADs的改变甚为少见。     

TGF-β1短时处理降低肝癌细胞与Fn的粘附及FAK的磷酸化

为了研究TGF-β1对α5β1整合蛋白所介导的信号转导通路是否有快速的信号调节作用,本文用TGF-β1短时(10min)处理SMMC7721细胞,发现当经TGFβ1预处理的细胞与Fn粘附时,细胞与Fn的粘附力下降,由Fn与整合蛋白的结合而诱导发生的FAK的酪氨酸磷酸化随着TGF-β1浓度的增加而降低。而TGF-β1短时处理并未改变整合蛋白α5、β1亚基的表达。此外,贴壁生长于培养皿的细胞的FAK磷酸化程度在TGF-β1短时处理后也下降,甚至检测不出。提示TGF-β1可能通过某种信号通路快速调节了整合蛋白与配体的亲和力以及下游信号分子FAK的磷酸化。从而影响了细胞内骨架蛋白结构的完整性,使细胞发生去极性化,有利于细胞在迁移早期的松脱。     

Endo180半胱氨酸富集区与I型胶原蛋白C末端分子的体外相互作用

I型胶原蛋白(type I collagen)是由2条α1链和1条α2链构成的纤维状异源三聚体.它是构成细胞外基质最主要的成分. I型胶原蛋白和内吞胶原蛋白受体Endo180(Endocytic 180)之间的相互作用在细胞基质的粘附和降解过程中起着关键性作用. 但内吞胶原蛋白受体Endo180与胶原蛋白的结合区域尚未有相关的报道.本研究在体外通过酶联免疫吸附、蛋白免疫沉淀和Western印迹等多种定量分析实验发现,用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）标记I型胶原蛋白C末端（氨基酸1151～1464）后形成的分泌型三聚体融合蛋白AP-Coll-S, 可与用抗体恒定区（antibody constant fragment, Fc）标记的Endo180的半胱氨酸富集区（CysR) 结合. 从而表明,AP-Coll-S和CysR-Fc之间存在相互作用. 本研究结果为进一步研究胶原蛋白和其受体Endo180的分子间相互作用提供新依据.     

七氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的改善机制

目的:探究七氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响,以及转化生长因子-β2(TGF-β2)/Smad3信号通路的活化情况。方法:将50只SD大鼠随机分为5组(n=10):假手术组、模型组、七氟醚预处理组、吡非尼酮组和七氟醚预处理+吡非尼酮组。通过右颈内动脉(ICA)缝线结扎方法制备脑缺血再灌注(I/R)损伤模型。建模前1h,七氟醚组大鼠吸入2.0%七氟醚1h,吡非尼酮组大鼠腹膜内注射200 mg/kg的TGF-β2抑制剂吡非尼酮,七氟醚+吡非尼酮组大鼠同时应用两种药物处理。再灌注24 h后,通过Zea-Longa五级评分法评价大鼠神经功能缺损评分,处死大鼠并测量梗死体积。通过苏木精-伊红(HE)染色和Nissl染色评价脑组织损伤程度。TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)分析细胞凋亡。免疫荧光染色和Western blot检测TGF-β2、Smad3、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和CD34的表达情况。结果:七氟醚预处理明显降低了大鼠的脑梗塞面积和神经功能缺损评分。七氟醚预处理抑制了大鼠大脑皮质和海马CA1区的神经元凋亡。七氟醚预处理上调了TGF-β2、VEGF-A和CD34的表达,以及Smad3的磷酸化水平。TGF-β2抑制剂吡非尼酮处理均可减弱七氟醚的脑保护作用并抑制TGF-β2、VEGF-A和CD34的表达和Smad3的磷酸化。结论:七氟醚预处理通过激活TGF-β2/Smad3信号通路来减轻I/R损伤大鼠的脑损伤。     

G蛋白与整合素αⅡbβ3的双向信号转导

整合素是一类细胞表面受体家族分子,通过双向信号转导参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的粘附以及细胞的迁移.整合素αⅡbβ3(GPⅡb-Ⅲa)特异表达于巨核/血小板系,并且是其含量最多的膜糖蛋白,介导血小板的粘附、伸展、聚集等.G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中发挥重要作用,其中较受关注的是:异源三聚体G蛋白和小G蛋白Rap1参与整合素αⅡbβ3的内向外信号转导;小G蛋白(Rho A、Rac等)和Gα13参与整合素αⅡbβ3的外向内信号转导.在蛋白质结构与功能关系的层面,本文总结了G蛋白的结构、分类、功能以及近年来G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中作用的研究进展.