番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性.结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量.     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

水稻OsGSTLc启动子的分离和鉴定

半定量 RT-PCR 分析表明,OsGSTLc 在水稻根中的表达受绿磺隆的诱导.从水稻基因组中分离到的 OsGSTLc 读码框上游22171 bp 序列,在起始密码 ATG 上游-86 bp 处有 CAAT-box,但在 CAAT-box 与读码框之间没有典型的 TATA-box.因此,OsGSTLc 启动子是无 TATA 框启动子.将 OsGSTLc 启动子5′-端系列缺失后,分别与 GUS 报告基因融合,获得 GSTL2171：GUS 、GSTL 1761：GUS 、GSTL 962：GUS 和GSTL 525：GUS 表达载体,利用农杆菌介导转化水稻,获得转基因水稻,均能启动下游 GUS 报告基因的表达.氯磺隆处理后,转入 GSTL 2171：GUS 、GSTL 1761：GUS 和 GSTL 962：GUS 的水稻植株根部的 GUS活性明显增加.氯磺隆诱导的应答元件在-962~-525 bp 的范围内.     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

水稻OsNRT1-d启动子的分离和功能分析

采用PCR技术,从水稻基因组中分离到OsNRT1-d读码框上游2 019 bp序列.序列分析表明:在起始密码ATG上游-189 bp和-127 bp处分别存在CAAT-box和TATA-box,具有典型的启动子结构.推测的转录起始位点CAC位于起始密码ATG上游-93 bp处.将OsNRT1-d启动子5′-端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得的NRT2019∷GUS、NRT1196∷GUS 和NRT719∷GUS转基因载体.农杆菌介导转化水稻,获得的转基因水稻均能启动下游GUS报告基因在水稻的根、叶、花颖和种子中表达;将转基因水稻幼苗放在滤纸上紧急干旱处理和用15% PEG6000进行模拟干旱处理,GUS基因的表达量明显升高,且干旱应答元件在-719 bp～-1 bp的范围内;GUS活性分析表明:OsNRT1-d启动子对ABA、NaCl、(NH4)2SO4、KNO3和Gln等信号没有应答反应.     

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe-GUS融合基因。经农杆菌介导,将不同的融合基因导入水稻中,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明,sbe1启动子可驱动反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。     

水稻细胞质1，6—二磷酸果糖酶基因1195bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6－二磷酸果糖酶（EC3．13．11）催化1,6－二磷酸果糖分解为6－磷酸葡萄糖和无机磷酸。在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6－二磷酸果糖酶：即叶绿体型1,6－二磷酸果糖酶和细胞质型1,6－二磷酸果糖酶。由于细胞质型1,6－二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水解细胞质型1,6－二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β－葡糖醛酸酶（GUS）报告基因建成嵌合表达载体。采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性。组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞,泡状细胞,维管组织中均无表达,在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达,在根,茎所有细胞中均没有蓝色反应,为进一步研究1,6－二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS活性进行了荧光定量分析。结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7031．5pmol4-MU^-1.min^-1.mg蛋白。在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片,叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性,实验结果表明,ATG上游1195bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件。     

水稻蜡质基因5'上游区中31 bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻蜡质基因 (Wx) 5’上游区中一个与胚乳核蛋白结合的 31bp序列在基因表达中的作用 ,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Wx启动区与 β 葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)编码区连接 ,构建成嵌合质粒。将这些质粒通过农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织 ,并分化产生转基因植株。分别测定抗性愈伤组织中与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明含有 31bp序列的比不含此序列的Wx启动区使GUS报告基因的表达水平高出 2～ 3倍     

荔枝LcVSP1基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质LcVSP1基因的5'调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,LcVSP1基因的5'调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明LeVSP1的5'调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

Homologous recombination-mediated knock-in targeting of the MET1a gene for a maintenance DNA methyltransferase reproducibly reveals dosage-dependent spatiotemporal gene expression in rice

Although homologous recombination-promoted knock-in targeting to monitor the expression of a gene by fusing a reporter gene with its promoter is routine practice in mice, gene targeting to modify endogenous genes in flowering plants remains in its infancy. In the knock-in targeting, the junction sequence between a reporter gene and an endogenous target promoter can be designed properly, and transgenic plants carrying an identical and desired knock-in allele can be repeatedly obtained. By employing a reproducible gene-targeting procedure with positive–negative selection in rice, we were able to obtain fertile transgenic knock-in plants with the promoterless GUS reporter gene encoding β-glucuronidase fused with the endogenous promoter of MET1a , one of two rice MET1 genes encoding a maintenance DNA methyltransferase. All of the primary (T₀) transgenic knock-in plants obtained were found to carry only one copy of GUS , with the anticipated structure in the heterozygous condition, and no ectopic events associated with gene targeting could be detected. We showed the reproducible, dosage-dependent and spatiotemporal expression of GUS in the selfed progenies of independently isolated knock-in targeted plants. The results in knock-in targeted plants contrast sharply with the results in transgenic plants with the MET1a promoter -fused GUS reporter gene integrated randomly in the genome: clear interindividual variation of GUS expression was observed among independently obtained plants bearing the randomly integrated transgenes. As our homologous recombination-mediated gene-targeting strategy with positive–negative selection is, in principle, applicable to modify any endogenous gene, knock-in targeting would facilitate basic and applied plant research.     

AtSTP3, a green leaf-specific, low affinity monosaccharide-H+ symporter of Arabidopsis thaliana

This paper describes the expression analyses of the AtSTP3 gene of Arabidopsis thaliana, the functional characterization of the encoded protein as a new monosaccharide transporter, and introduces the AtSTP gene family. The kinetic properties of the AtSTP3 protein (for sugar transport protein 3) were studied in a hexose transport deficient mutant of Schizosaccharomyces pombe. AtSTP3 represents a new monosaccharide transporter that is composed of 514 amino acids and has a calculated molecular mass of 55·9 kDa. Kinetic analyses in yeast showed that AtSTP3 is a low affinity, energy‐dependent H ⁺ symporter with a K_m for D ‐glucose of 2 m M . RNase protection analyses revealed that AtSTP3 is expressed in leaves and floral tissue of Arabidopsis. This expression pattern of the AtSTP3 gene was confirmed in AtSTP3 promoter‐ β ‐glucuronidase (GUS) plants showing AtSTP3‐driven GUS activity in green leaves, such as cotelydons, rosette and stalk leaves and sepals. Wounding caused an induction of GUS activity in the transgenic plants and an increase of AtSTP3 mRNA levels in Arabidopsis wild‐type plants. Polymerase chain reaction analyses with degenerate primers identified additional new AtSTP genes and revealed that AtSTP3 is the member of a large family of at least 14 homologous genes coding for putative monosaccharide‐H ⁺ symporters (AtSTPs).     

pib基因启动子及其诱导启动性初探

将pib基因上游5.7 kb区段取代pCAMBIA1301中gus基因上游的35S启动子构建了pib拟启动区-GUS+ 35S-hpt 基因表达载体pNAR604。经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤,获得了转基因抗潮霉素愈伤和36株转基因水稻植株。 转基因抗性愈伤和转基因植株根的组织化学GUS活性检测表明,光照培养下的抗性愈伤和转基因植株根不能使X-gluc显色,而暗处理24 h后的抗性愈伤和定植后转基因植株的根能使X-gluc显色。转基因植株GUS荧光定量分析结果表明,GUS表达具有器官特异性,黑暗处理前根的GUS活性最高、茎次之,分别是是叶片的7倍和3倍,叶片中仅有痕量本底。24 h黑暗处理后根、茎、叶中GUS活性都有增加,且叶片中的增加比例最大,其活性仅次于根。5 mmol/L水杨酸和0.3 mol/L NaCl叶面喷施转基因植株24 h后叶片中GUS活性分别为处理前的2.7和3.6倍。初步确定pib拟启动区是一个诱导型启动子。黑暗、水杨酸和NaCl能诱导该启动子启动活性。     

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统。以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。