农抗5102产生菌原生质体融合育种的研究Ⅳ．融合子FR—008的验证及其产生新活性物质的分离和鉴别

本文在探索5102－l号抗生素液相色谱HPLc)分析法的基础上,从出发菌株10—22和融合子FR-008的发酵物中均分离出5102—1号抗生素的主要组分,进一步证实融合子FR·008为吸水链霉菌应城变种种内融合的重组子。实验还从融合子FR一008的发酵物中分离和纯化了出发菌株不能产生的活性物质,通过与浓硫酸和浓盐酸反应呈深兰色,紫外可见光谱在403,380,360,340nm处有吸收峰等特征,表明它是一种七烯大环内酯类抗生素。在建立该抗生素中芳香残基的液相色谱分析法时,证明其中含有对氨基苯乙酮残基。用氨基酸分析仪测定经硫酸甲醇醇解和醇解产物再水解后的抗生素样品,表明它含有与已知七烯大环内酯类抗生素不同的氨基糖残基,其详细结构有待进一步研究确定。     

JK-008提取生物转化液浓缩母液中L-苯丙氨酸

采用JK-008阳离子交换树脂对生物转化反应液浓缩母液中L-苯丙氨酸进行提取,结果显示效果良好,交换率达90%,且易于被2mol·L-1氨水动态洗脱,洗脱率在95%左右,结合蒸汽浓缩方法可以运用于工业化生产L-苯丙氨酸的母液后处理工艺。     

SDS—PAPGE法测定His—tag融合蛋白分子量产生偏差的原因

Ｈｉｓ－ｔａｇ／Ｎｉ－ＮＴＡ系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测Ｈｉｓ－ｔａｇ融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大,产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题,本实验室在研究一个Ｈｉｓ－ｔａｇ融合蛋白Ｐ７３－Ｈｉｓ时,首先用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测得其分子量确实比理论计算值大,然后对     

pLXSN-MICA~* 008和pLXSN-MICA~* 001在人成纤维细胞表达

目的:建立表达MICA* 008和MICA* 001蛋白的人包皮成纤维(human foreskin fibroblast,HFF)细胞,为研究MICA基因的免疫功能提供生物学材料。方法:组织块法原代培养HFF细胞;用脂质体将质粒pLXSN,pLXSN-MICA* 008和pLXSN-MICA* 001转染PA317包装细胞后收集病毒颗粒,再将病毒颗粒感染HFF细胞,G418筛选14天,扩增耐药细胞,westernblot检测MICA* 008和MICA* 001蛋白表达情况。结果:逆转录病毒载体pLXSN,pLXSN-MICA* 008和pLXSN-MICA* 001经包装细胞PA317包装可产生有感染能力的病毒,该病毒感染HFF细胞后,westernblot检测出外源蛋白MICA* 008和MICA* 001。结论:建立了表达MICA* 008和MICA* 001蛋白的人成纤维细胞。     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

用原生质体融合技术选育2—酮基—L—古龙酸高产菌株的研究

对革兰氏阳性的地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和革兰氏阴性的２－酮基－Ｌ－古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体的制备条件进行了研究,并采用聚乙二醇作诱导剂进行了两菌株的原生质体融合,用链霉素作为抗性标记对融合子进行了选择。从１７株产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子１５号。融合子１５号具有两个亲本菌株所具有的一些特性。     

红光与远红光比值对温室切花菊形态指标、叶面积及干物质分配的影响

以切花菊品种‘神马’(Chrysanthemum morifolium Ramat ‘Jinba’)为试材,于2010-2011年设计不同红光(R: (660 ±10) nm)与远红光(FR: (730±10)nm)比值(R/FR分别为0.5、2.5、4.5、6.5)的LED灯照射处理,研究不同R/FR值对温室切花菊形态指标、叶面积形成及干物质分配的影响。结果显示R/FR=2.5处理的植株叶片数、株高、茎粗、花径、叶面积及总干重均为各个处理中最高,R/FR=0.5处理的节间最长。所有R/FR处理的单株地上干物质重量与光质处理天数呈指数-线性模型。随处理天数的增加不同R/FR值处理菊花植株地上部分及地下部分干物质分配指数差异均不显著,叶片和花的干物质分配指数随处理天数的增加分别呈降低和升高的趋势,茎干物质分配指数则呈现先升高后降低的趋势,R/FR=2.5处理下,菊花叶片干物质分配指数和花干物质分配指数最高,而茎干物质分配指数却为最低;R/FR=6.5处理茎干物质分配指数最高,叶片干物质分配指数最低;0.5处理花朵干物质分配指数最低,说明远红光比例增加能够促进干物质向茎中分配,R/FR=2.5处理利于干物质向花朵中分配。     

重组人IL6／2融合蛋白对6.5Gy照射小鼠造血功能恢复的影响

观察了ｈＦＰＩＬ６／２对６．５Ｇｙγ线照射ＮＩＨ小鼠第１０天造血功能恢复的影响。结果表明：照射小鼠连续４ｄ给予ｈＦＰＩＬ６／２２５０μｇ·ｋｇ－１·ｄ－１,其脾重、ＣＦＵ－８、骨髓有核细胞数及ＣＭ－ＣＦＵ分别比对照组增加５９．０％、２７８．５％、５７．９％和１３８．２％,统计学处理均有显著差异;对此四项指标的改善也明显优于２５μｇ组。另外,２５０μｇ剂量组小鼠外周血象３０ｄ的动态观察结果表明,ｈＦＰＩＬ６／２不但能明显提高红细胞和血红蛋白的最低值,而且能使血小板的恢复提前。提示ｈＦＰＩＬ６／２在促进血小板生成和促进红系造血方面可能具有良好的应用前景。     

啤酒酵母融合株QSB-Ⅺ6的发酵试验

从选育构建的大量融合子中,得到了较好的、各具特色的近百株啤酒酵母菌株,在进行小型发酵试验及理化指标鉴定的基础上选出了由出发菌株LQ16与QSB7得到的融合株QSB-Ⅺ6,经六个批次的小试发酵与生产性能、理化指标的全面鉴定,证实QSB-Ⅺ6是一株口味独特、发酵率高、凝絮性强兼具多种优良性状的啤酒酵母新菌株.     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

欧文氏菌和棒杆菌的属间融合研究*

研究了用原生质体融合技术获得欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞。串联发酵Ｄ－葡萄糖产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的第一步发酵菌株欧文氏菌ＳＣＢ２４７经０．８ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解０．５ｈ后,原生质体的形成率和再生率分别为９９．８％和２７．８％。第二步发酵菌株棒杆菌ＳＣＢ３０５８经预处理后由１．３ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解２ｈ,原生质体的形成率和再生率分别为９９．５％和５６．３％。用携带氨苄青霉素抗性标记的ＳＣＢ２４７和经热灭活的ＳＣＢ３０５８为亲本,在４０％ＰＥＧ６０００和０．２ｍｏｌ／Ｌ新生磷酸钙等适宜条件下融合,融合频率为３．６×１０~(－６)。在非选择和选择培养基上连续传代十几次后,对融合子的单菌形态、染色结果、菌落形态、色泽、总蛋白量、同工酶、发酵性能等方面与亲本进行了比较。结果表明,融合子确系棒杆菌和欧文氏菌的融合细胞。摇瓶发酵结果显示,所得的３８株稳定的融合子中约４０％能转化葡萄糖为维生素Ｃ前体２－酮基－Ｌ－古龙酸。     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnB—lacZ融合子的构建

亚克隆了Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓｇｌｎＢ启动子,以ｐＭＰ２２０为载体构建成ｂｌｎＢ－ｌａｃＺ融合子。将ｇｌｎＢ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＡ＝ｌａｃＺ分别导入Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ谷氨酸合酶突变株ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响,试验证明,在ｇｌｔＢＤ突变株中ｎｉｆＨ的表达受阻遏,ｎｉｆＡ表达水平很低。这证明ｇｌｔ基因的突变引     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184）融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95％以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80％以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

青菜与芥菜花粉－体细胞原生质体融合的研究

以聚乙二醇（ＰＥＧ）为诱导剂,试验用４种方法进行青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体的融合,结果以修改的Ｔｅｒａｄａ等的方法最好。融合后原生质体的培养形成了愈伤组织,但未分化出芽,个别愈伤组织分化了根。用ＲＡＰＤ技术对任选的５个细胞系进行鉴定,发现１个细胞系含双亲的ＤＮＡ片段,可确认是青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系。     

青菜与芥菜花粉－体细胞原生质体融合的研究

以聚乙二醇（ＰＥＧ）为诱导剂,试验用４种方法进行青菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）幼嫩花粉原生质体与芥菜（Ｂ．Ｊｕｎｃｅａ）下胚轴原生质体的融合,结果以修改的Ｔｅｒａｄａ等的方法最好。融合后原生质体的培养形成了愈伤组织,但未分化出芽,个别愈伤组织分化了根。用ＲＡＰＤ技术对任选的５个细胞系进行鉴定,发现１个细胞系含双亲的ＤＮＡ片段,可确认是青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系。     

不同R∶FR值对菊花叶片气孔特征和气孔导度的影响

以切花菊品种"神马(Jinba)"为试材,2010年10月至2011年2月间在南京信息工程大学试验温室采用不同Red (660±10) nm: Far-red (730±10) nm值的LED光源短日处理,研究了温室切花菊叶片气孔特征和气孔导度对不同R∶FR值的响应。结果表明:不同R∶FR值短日处理35d菊花叶片的上表皮和下表皮的气孔直径分别以R∶FR值4.5和6.5处理最大,均以R∶FR值2.5处理最小,气孔密度和气孔开度均以R∶FR=2.5处理最高,以R∶FR值6.5处理最低,下表皮的气孔密度、气孔开度明显高于上表皮;不同R∶FR值处理叶片的气孔开张比和气孔指数差异不显著;在相同光强下,菊花叶片气孔导度和光合速率由大到小的R∶FR值顺序依次为2.5、4.5、0.5、6.5。叶片气孔导度与气孔指数、气孔密度、气孔开张比和气孔开度成正相关,与气孔长度和气孔宽度呈负相关;R∶FR值在2.5-6.5范围内,随光质中红光成分增加,叶片气孔密度、气孔指数、气孔开度、气孔开张比和气孔导度显著降低。     

原位PCR技术研究鼻咽癌组织中bcl-2／JH融合基因

为研究bcl-2／JH融合基因与鼻咽癌发生的关系,应用兰套式原位PCR技术对41例石蜡包埋鼻咽癌组织中bcl-2/JH融合基因进行检测。结果发现41例癌组织中bcl-2／JH融合基因阳性6例,阳性率为14.6%,bcl-2基因的两个热点断裂区mbr和mcr与免疫球蛋白重链JH形成的融合基因mbr-JH和mcr-JH各占50％。bcl-2／JH融合基因形成与癌组织学分级和转移间无明显关系（P＞0.05）。本表明bcl-2/JH融合基因与鼻咽癌发生可能有一定关系,其中mbr-JH和mcr-JH同为bcl-2基因在鼻咽癌的两个重要基因异常改变形式。