腺病毒介导的猪生长激素cDNA在大鼠体内的诱导表达及其促生长作用的研究

用同源重组的方法制备了在羊金属硫蛋白(MT)启动子控制下的猪生长激素(pGH)cDNA的重组腺病毒(MTCD—reAdV),将其感染CHO细胞,48h后在细胞培养基中检测到有pGH的表达。为在动物体内证实该重组腺病毒的促生长功能,通过心脏将重组腺病毒注射到大鼠的血液中(每只大鼠注射滴度为TICD50 10^l0的MTCD-reAd0.5ml）,经过硫酸锌间歇性诱导,结果表明,在注射后的19天内,注射MTCD-reAdV大鼠的体增重明显(P＜0．05)高于对照组(注射空病毒)。由此可见,由腺病毒介导的pGH基因具有明显促进大鼠快速生长的作用。     

重组人生长激素在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达研究

对重组人生长激素基因工程菌ｐＥＴ－１１ｂ／ｒｈＧＨ／ＢＬ２１的培养条件进行了优化,在ＮＢＳ ＭＰＰ－４０发酵罐中实现了高密度培养和高效表达,三批实验结果表明,在较短的发酵时间（１２ｈ）内细菌干重达８５ｇ／Ｌ,重组人生长激素占总蛋白量的２５％左右。     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

重组猪生长激素表达研究进展

猪生长激素作为猪生长发育过程中起主导作用的蛋白质激素,能增加肌肉组织蛋白含量、降低脂肪含量、促进骨骼发育、刺激乳汁分泌等,是畜牧养殖业中值得开发利用的激素之一。利用基因工程技术生产重组猪生长激素使猪生长激素在生产上应用成为可能。本文简要介绍了猪生长激素,总结了重组猪生长激素表达的研究进展,并展望了重组猪生长激素的应用与发展前景。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素(pGH)基因的cDNA进行测序,得到pGH cDNA的全序列,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论.然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒pSXIVVI+X3/4构建出含pGH基因的重组质粒pX3/4-pGH.将pX3/4-pGH与致死缺失型线性化AcMNPV-OCC- DNA共转染Sf9细胞,构建出既能形成多角体又能表达pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV-pX3/4-pGH-OCC+.感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS-PAGE和Western blot的分析结果表明,感染细胞的蛋白电泳带的20.7 kDa处有一条猪生长激素特异带,但培养上清中没有.凝胶黑度扫描估测结果显示pGH蛋白占细胞可溶蛋白的4.48%.     

人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达

经密码子优化的人工合成草鱼生长激素cDNA与表达载体pET-28a( )重组,构建重组表达质粒PET－GH。转化在肠杆菌BL21（DE3）,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达,12．5％的SDS－PAGE分析显示,大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的新增蛋白带,激光密度扫描,其产量约占菌体总蛋白的40％,金属离子螯合层析柱亲和纯化,获得电泳纯的重组蛋白。Western-blotting和酶联免疫吸附受体法检测证实,重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合;复性合的重组蛋白有与天然草鱼生长激素一致的生物学活性。     

由大肠杆菌中提取重组猪生长激素的研究

 本文通过研究提出了一种由大肠杆菌细胞中提取重组猪生长激素的方法。提取回收率为52.4％,纯度为94.1％,具有生物学活性。     

外源猪生长激素基因在金鱼体内的整合与表达研究

自1982年Palmiter^[1]等人给小鼠受精卵雄原核注射大鼠生长激素基因培养成功“超级”鼠以来,由于人们认识到转基因技术导致动植物品种定向改良以及利用转基因动物作为生物反应器,大量合成和分泌贵重而安全的基因工程产品,因此转基因动物技术得到了迅速发展,相继开展了兔、鱼、猪、鸡、牛、羊等动物的转基因研究,并取得了一定的结果^[2,3,4]。但是在上述具有经济价值的高等脊椎动物中从事转基因研究,成本高、操作困难,而金鱼属于低等脊椎动物．具有产卵多、易获得同步卵、可控制体外受精和体外发育等特点,因而成为转基因动物研究的方便材料。生长激素是动物脑下垂体前叶分泌的单链多肽⑸,生理功能是促进碳水化合物代谢及核酸、蛋白质合成,整体效应表现为动物生长。本文以金鱼为实验材料,探讨猪生长激素基因导入其受精卵后整合、表达以及生物效应等问题,为进一步研究外源基因在高等动物内整合和表达调控机理提供参考。     

草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达

为大量获得具有生物学活性的草鱼生长激素,对草鱼生长激素cDNA在毕赤酵母中的表达进行了研究。将草鱼生长激素cDNA克隆入毕赤酵母表达载体pGAPZ-α-B,构建表达载体pGAPZ-α-B-GH。在三磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子的调控作用下,一个类似于天然生长激素大小、分子量约22kD的蛋白获得表达,其表达量约50mg/L。Western杂交表明：表达的蛋白与兔抗草鱼生长激素的多克隆抗体特异结合,证实该表达蛋白为草鱼生长激素;受体夹心式ELISA检测表明：表达的草鱼生长激素具生物学活性,能与不同种鱼来源的肝膜受体特异结合。     

乳糖诱导耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达

考察乳糖代替IPTG诱导耐热木聚糖酶基因在重组大肠杆菌BL21中表达的可行性。分别以IPTG和乳糖作为诱导剂,对诱导时机、诱导剂浓度、诱导持续时间等主要因素进行了分析比较。结果表明,当菌体生长至发酵液吸光值OD600达1．3时加入乳糖其终浓度达29．2 mmol／L,37℃,持续诱导9．5h,木聚糖酶活力达到最高,为3587.5U,是IPTG优化条件下持续诱导7h达到的最高酶活的2．07倍,而成本只有IPTG的1／204。     

猪生长激素研究进展

猪生长激素是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素。本文就猪生长激素基因的结构特点,多肽性研究、基因表达及猪生长激素的结构特点、生理功能、分泌规律及与其抗体的相互作用等方面进行了综述。     

在大肠杆菌中高效表达重组Protein A

本文构建了高效表达质粒pPA-3,其在大肠杆菌中表达的重组Frotein A仅含天然Prot—ein A的免疫球蛋白Fc段结台区,表达量达菌体可溶蛋白的20％。sDs—PAGE及western—b1ot结果显示,重组protein A的分子量有4种,即33、32．2,29．5和28．6kDa,其中33kDa与理论计算结果一致,推测其它分子量可能是由于胞内蛋白酶降解所致。一步亲和层析即可将重组Protein A从细胞裂解上清液中纯化出来。火箭电泳及酶联免疫分析结果表明,等蛋白量的该重组Protein A比天然Protein A能结台更多的免疫球蛋白。     

猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析

利用含有强启动子P_AOX1 和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut⁺) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N 糖基化加工修饰     

GHcDNA克隆在大肠杆菌中表达将有望应用于水生鱼类动物

猪生长激素 (ＧＨ)为单一的多肽 ,无亚基 ,不要糖基化修饰 ,只含 2个硫键 ,有重复的特性 ,并能在大肠杆菌体内进行表达 ,其表达量为 2 0 .5 %。但在构建鲑鱼ＧＨ、鲤鱼ＧＨ的表达载体分别为 ｐＢＶｓＧＨＩ8和ｐＢ ＶｃＧＨ8时 ,其表达量分别是 10 %和 2 9.2 %。当猪ＧＨ基因同用大肠杆菌、鲑、鲤进行表达 ,其表达载体均为ｐＢＶ2 0 0时 ,各个表达量仍有很大差异。这主要是外源基因在同一表达载体中所表达的水平不同有关 ,亦即外源基因 5′端ＡＵＧ附近的ＲＮＡ二级能量的大小、ＡＵＧ与ＳＤ序列之间的距离大小 ,外源基因 3′测翼稳定性的强…