模拟微重力条件下WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境。以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型。并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白(E-cadherin)表达情况。结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白(Fn)mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制。该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究。     

使用旋转式生物反应器体外扩增人表皮细胞

目的:使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器容器作为培养系统大规模扩增人表皮细胞(hECs)。方法:使用中性蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA两步骤法从人皮肤中分离出人表皮细胞,使用DIL标记细胞后结合微载体后在旋转式生物反应器(RCCS)中培养,细胞贴附微载体的生长状态使用倒置显微镜,扫描电镜观测。并且分析细胞群体倍增时间来比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异。结果:在旋转式生物反应器的微重力培养体系中,人表皮细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,并且表现出很强的增殖能力和细胞活性。结论:使用旋转式生物反应器和微载体悬浮培养人表皮细胞,是大量制备皮肤组织工程种子细胞的一种有效方法。     

微载体浓度与细胞接种密度对ST细胞生长的影响

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率,优化微载体培养体系猪睾丸细胞(Swine testicle cells)的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM(Low serum medium)两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响,进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex1微载体的利用率。结果显示,使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30d,平均比生长速率为0.626d~(0-1),是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×10~5cells/mL细胞接种3g/LCytodex1搅拌瓶体系,最大细胞密度为38.3×10~5cells/mL,微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15d,最终细胞密度达到36.6×10~5cells/mL,扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长,实现高密度生长,另一方面增加了微载体的使用成本,选择合适的微载体浓度、细胞接种密度,能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。     

组成型过量表达hTERT 对Vero 细胞体外培养生物学特性的影响

目的:考察组成型过量表达人端粒酶催化亚单位(hTERT)对Vero细胞在无血清培养体系中的细胞形态、生长和代谢的影响。方法:以组成型过量表达hTERT的Vero细胞系T1为研究对象,以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标,结合细胞形态和贴附伸展动态,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生成速率(qlac)、乳酸转化率(Ylac/glc)和谷氨酰胺比消耗率(qgln)为反映细胞代谢的主要观察指标,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。结果:hTERT组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力和对血清的依赖程度的同时,提高了细胞无血清批次培养后期的细胞活力和活细胞密度,并赋予了T1非贴附依赖性生长的能力。hTERT组成型过量表达未对Vero细胞的代谢产生明显的影响。结论:hTERT组成型过量表达可降低Vero细胞的贴附生长依赖性和对血清的依赖程度,是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。     

气液双升式反应器动物细胞培养及批式生长动力学模型

初步研究了气液双升式动物细胞反应器微载体培养 Bowes细胞和悬浮培养 M4G3杂交瘤细胞的生长条件 ,在不加入消泡剂和保护剂的情况下 ,批式培养 Bowes细胞的最大密度为 2 .6×1 0 6/ml,批式培养 M4G3细胞的最大密度为 1 .5× 1 0 6/ml。基于细胞生长的密度效应 ,建立了动物细胞生长动力学模型 :　　 μ=0　　 t相似文献   

微载体培养动物细胞技术的研究进展

微载体是一种新兴的大规模细胞培养技术,是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。它具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势,培养条件(温度、pH值、二氧化碳浓度等)容易控制,并且培养过程系统化、自动化,不易被污染。本文简要介绍了近几年来常用的几种制备微载体的天然聚合材料,比较了固体微载体和液体微载体各自特点,列举了微载体培养技术的几种生物反应器系统。     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时,由于没有血清提供各种贴壁因子,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中,CHO细胞往往以贴壁方式培养,要么贴壁于悬浮的微载体中,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达lgf-1和Bcl-2基因,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO-IB3。在此基础上,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI—NII—IVB。将该载体转染于CHO—dhfr^-细胞中,构建了一个细胞株CHO—IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长,适于以贴壁的方式大规模培养,用于大量生产外源目的蛋白。     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI-NII-IVB。将该载体转染于CHO-dhfr^- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO-IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 ,用于大量生产外源目的蛋白.     

使用旋转式生物反应器体外扩增人表皮细胞

目的：使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器容器作为培养系统大规模扩增人表皮细胞（hECs）。方法：使用中性蛋白酶和胰蛋白酶．EDTA两步骤法从人皮肤中分离出人表皮细胞,使用DIL标记细胞后结合微载体后在旋转式生物反应器（RCCS）中培养,细胞贴附微载体的生长状态使用倒置显微镜,扫描电镜观测。并且分析细胞群体倍增时间来比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异。结果：在旋转式生物反应器的微重力培养体系中,人表皮细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,并且表现出很强的增殖能力和细胞活性。结论：使用旋转式生物反应器和微载体悬浮培养人表皮细胞,是大量制备皮肤组织工程种子细胞的一种有效方法。     

重组HSV-Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养生产工艺研究

经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(rHSV-Ⅱ)在体外具有良好的溶瘤效果,并对小鼠体内B16R黑色素瘤内注射具有较高的疗效。重组HSV-Ⅱ病毒作为高效的新型溶瘤病毒疫苗有望用于肿瘤的临床治疗。Vero细胞是广泛应用于病毒疫苗生产的细胞基质,该细胞系对多种病毒敏感且产量高,其微载体培养安全,开发重组HSV-Ⅱ溶瘤病毒肿瘤疫苗的Vero细胞微载体反应器悬浮培养生产工艺具有重要的意义。以自主开发的低血清培养基为基础,对Vero细胞的反应器微载体球转球转移放大工艺及在位消化放大培养工艺进行了研究和比较,以新老微载体比3:1的比例成功实现了微载体球转球转移放大,建立了可实现至少四次/级连续放大的球转球转移放大培养工艺,可用于工业化生产过程。在此基础上,初步建立了以Vero细胞为基质的重组HSV-Ⅱ病毒疫苗反应器微载体无血清悬浮培养生产工艺,最大病毒滴度可达到6.62 lgTCID50/ml以上。为以Vero细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便、高效的工艺方法。     

新型温敏微载体用于无损收获贴附型细胞的研究

聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝的微载体由于表面同时含有疏水性的异丙基和亲水性的酰胺基而成为一种典型的温敏性微载体。但是微载体表面PNIPAAm接枝浓度会很大地影响贴附型细胞在微载体上的贴附能力和脱附能力,限制了它在相关领域的应用效果。该实验运用原子转移自由基聚合作用(atom transfer radical polymerization,ATRP)合成法将PNIPAAm接枝到表面氯甲基化的聚苯乙烯微球[chloromethylated poly(styrene),CMPS]表面,合成不同PNIPAAm接枝浓度的温敏微载体,研究其细胞贴附、脱附以及在转瓶悬浮培养中的细胞增殖能力。同时,运用电子扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)、X-射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)对温敏微球表面形貌进行表征。实验结果表明,当PNIPAAm添加浓度是200 mmol/L时,温敏微球表现出60%的细胞脱附率及50%的细胞贴附率,并且在转瓶悬浮培养中具有持续稳定的增殖能力。另外,SEM与AFM表征结果显示,温敏微载体表面粗糙度有明显地增加;XPS结果表明,温敏微球表面N元素有显著增加。这些结果证明了微载体上温敏材料NIPAAm的成功接枝。以上实验结果表明,这种新型温敏微载体具有良好的细胞贴附和脱附能力,将会是大规模培养贴附型细胞的良好材料。     

动物细胞培养及单克隆抗体

942224 在哺乳动物细胞中表达重组抗体并分泌碱性磷酸酶 [英3/Rather,A.!J.…/Appl.Microbi01. Biotechn01.一1994,40(6).-851～856E译自 DBA,1994,13(7),94—03868] 测试了表达重组抗体(rAb)的Sp2/0细胞系 F3blo和表达相同rAb(分离自同一质粒(BHK ·IgG))或分泌碱性磷酸酶(BHK·SEAP)的 BHK21细胞的生长和产率,该rAb含有小鼠IgGl 抗体可变区和人IgGl分子恒定区。F3blo细胞系 以单细胞悬浮方式生长,BHK细胞则以自然聚集 方式悬浮生长或固着在Gytodex-3微载体上。在 F3b10~~,细胞的~LrAb产率随着比生长率(u)的 提高而提高;…     

流加微载体半连续培养分泌HBsAg的rCHO细胞过程研究

本文在固定浓度微载体半连续培养rCHO细胞动力学研究的基础上,通过逐步补加新的微载体以不断提高供细胞生长的表面,提高了细胞密度和产物的表达量。建立了流加微载体半连续培养rCHO肿细胞收获HBsAg的工艺,确定了此种培养方式的最大微载体浓度,为建立微载体连续培养rCH0细胞生产HBsAg技术,实现细胞高密度和产物高表达奠定了基础。     

固相化HEK细胞在无血清培养基中高效表达重组人活性蛋白C

研究固相化HEK工程细胞的培养和产生rhAPC的水平。先将HEK细胞由贴壁适应为无血清悬浮培养,再用海藻酸钙固定,并在无血清培养基中悬浮培养(最高约为27mg/L)。固相细胞动态培养的表达水平高于细胞静态悬浮培养的表达水平(最高约为50mg/L)。固相细胞动态培养可实现细胞的高密度培养,得到较高的表达水平。     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

微载体上依赖于整全蛋白α2亚基的细胞与细胞外基质的粘附

Vero细胞是肾上皮细胞,合成并分泌层粘连蛋白和IV型胶原,从而在细胞外形成对细胞生长、迁移等有重要影响的细胞外其质膜。已知影响细胞与细胞外基质相互作用的蛋白质分子是整合蛋白。微载体所提供的三维立体培养条件与细胞在体内的生长、迁移条件相似,为在体外研究体内类似过程提供了很好的模型。通过蛋白质印迹法可以检测到：正常培养条件下,在微载体上培养48小时,Vero细胞表达整合蛋白α2亚基（Fig.la);如果同时加入层粘蛋白,α亚基的表达量显著提高（Fig.1b)。正常培养条件下,培养10天,Vero细胞在微载体上形成密集的多层生长,α2亚基表达量明显高于培养初期（Fig.1c)。间接免疫荧光标记（Fig.2)和免疫电镜观察（Fig.3）证实：在层粘连蛋白作用下,α2亚基大量表达,并定位于细胞“附着班”位置的细胞膜上。此时,如果再用抗层粘蛋白抗体处理,可观察到原“附着斑”消失,α2亚基在细胞内呈散布状（Fig.4)。整合蛋白α2亚基的表达和与层粘连蛋白的“附着斑”提供了Vero细胞在微载体上附着和迁移的基础。可能,不同的细胞外基质可以通过不同的整合蛋白来调节细胞活动。     

CHO工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型

以悬浮适应的表达尿激酶原CHO工程细胞为研究对象,在100mL的摇瓶中进行无血清悬浮培养,以细胞密度、细胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、乳酸对葡萄糖的得率系数(Ylac/glc)为观察指标,同时以细胞有血清悬浮培养作为参照,考察CHO工程细胞无血清悬浮培养生长和代谢特征。观察结果表明,CHO工程细胞在无血清及有血清悬浮培养条件下表现为大致相似的细胞生长和代谢特征。在此基础上,依据实际检测的数据,应用MATLAB软件对细胞对数生长期的细胞生长、乳酸生成及葡萄糖消耗的模型参数进行非线性规划,获得全局性收敛的最优参数估计值,建立了细胞在无血清培养条件下的生长及代谢动力学模型。     

中空纤维灌注培养模拟骨髓造血研究

采用细胞工程技术探索造血细胞体外扩增技术以维持其自我更新潜能,抑制过度分化。方法：首先建立微载体 基质细胞体外造血模型（G1组,即瓶培养模式）,设置单纯微载体 基质细胞培养（G2组）和单纯骨髓细胞液体悬浮培养（G3组）作对照。检测各组粒系 巨噬系造血祖细胞集落产率（CFU GM/105）。自行设计1对引物,以检测Balb/c小鼠原始造血细胞c kit基因mRNA表达水平。试用中空纤维模拟血管灌注功能（Gh组,即中空纤维灌注模式）,以G1、G2、G3作对照,并对各组培养效果进行评价。结果：微载体 基质细胞体外造血模型实验结果显示：小鼠骨髓细胞培养2周后,CFU GM/105检测G1组比G3组高7.7倍（P<0.05）,是2个对照组（G2+G3）集落产率总和的1.9倍。原始造血细胞c kit mRNA表达水平：模型G1组比G2组高3.7倍,比G3组高62.3倍,且差异均显著。在成功建立微载体 基质细胞体外造血模型基础上进行中空纤维灌注培养实验,CFU GM/105检测显示：Gh组比G3组高4.6倍,并且略高于G2组;Gh组与G1组集落产率差别不明显。在原始造血细胞c kit mRNA表达水平上Gh组最高,从Gh、G1、G2到G3依次呈下降趋势。结论：在没有外加细胞因子的条件下,微载体 基质细胞和中空纤维灌注造血模型可抑制造血干、祖细胞过度分化与耗竭,维持其c kit较高的表达水平。     

模拟微重力条件下 WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境.以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统（RCCS）模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型.并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白（E-cadherin）表达情况.结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白（Fn）mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制.该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究.