柑桔原生质体电融合研究进展

柑桔原生质体电融合研究进展刘继红︵华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉４３００７０︶柑桔是世界四大水果之一,也是我国南方最为重要的一种水果。由于柑桔是多年生木本植物,童期长,遗传上高度杂合,一些主栽品种雄性败育（如温州蜜柑）或／和雌性败育（如...     

黑曲霉原生质体电融合研究

以NTG和UV分别对生淀粉糖化酶菌株——野生型黑曲霉N 11,N一16(Aspergillusniger)进行诱变处理获Lys^-和Arg^-两类营养缺陷型。采用纤维素酶和蜗牛酶复合酶处理其菌丝并探讨了酶浓及菌龄等因素对原生质体形成和再生的影响。以BAEKON-2000型基因转移仪将上述营养缺陷型进行原生质体电融台处理。产生高融合率的最佳参数为：脉冲幅度4．5kV,脉冲数32,脉宽62．5μs,电激时间0.2s,距离3mm,周期数10。融合率可达60％。经连续传代7次获得4株稳定的融合子,经孢子体积,核DNA含量,生长速度测定证明上述融合子是种内杂合二倍体。以PFA处理得稳定的单倍体分离子。     

香菇和侧耳属间原生质体的电融合研究

从培养在液体培养基中的香菇、美味侧耳和平菇的单核菌丝用酶法分离了原生质体。施加0.5MHz、500PV/cm的正弦波和μs、6000PV/cm方形脉冲的电场诱导下使其电融合。电融合后的融合子和原生质体在固体培养基上植板培养成菌落。在显微镜下检查融合子菌株菌丝的锁状联合选出从融合子长成的菌株。香菇和美味侧耳的融合菌株产生频率为61.53%,香菇和平菇的融合菌株产生频率为32.58%。根据融合菌株与亲本的拮抗作用和他们的过氧化物同工酶和酯酶同工酶的电泳酶谱与其亲本酶谱的不同,证实这些融合菌株是从融合的异核体生长成的。同时讨论了电融合方法和结果。     

普通番茄叶肉原生质体和多毛番茄茎尖原生质体的电融合

普通番茄叶肉原生质体和多毛番茄茎尖原生质体在一交变电场中(正弦波;1mHz,200v/cm)可发生双向电泳而随机排列成串。再附加单个直流方波脉冲,可诱导相邻原生质体的融合,适宜的融合脉宽为40μs,电压幅度为3000v/cm。最高融合率可达57%。培养经电融合处理的原生质体,观察到了少数原生质体的第1次分裂。     

坛紫菜和条斑紫菜的原生质体电融合

用日本岛津公司生产的电融合装置(SSH－2),进行了坛紫菜和条斑紫菜的原生质体融合试验。探讨了不同的电刺激条件、融合缓冲液种类以及蛋白酶的前处理与细胞融台的关系。其结果是,高频电压30一35V,印加时间25—30s;脉冲电压300—350V,印加时间60μs,及添加3m mol／L Ca²⁺、Mg²⁺的融合缓冲液可使融台率达到21—31％。蛋白酶的前处理对细胞融合有明显的效果。融合细胞培养7天后产生细胞壁,4l天长成多细胞团。     

水稻原生质体电融合时的参数选择（简报）

水稻（0862和台北309）原生质体电融合最佳条件是交流电场强度250V／cm,频率600kHz;高压直流脉冲幅值1．65kV／cm,脉冲持续时间50μs,脉冲间隔时间3．0S。融合率最高可达275％．在上述条件下,电场处理基本不影响原生质体的活力。     

虎杖原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16（44）正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明：1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

凤尾菇和桃红平菇种间原生质体电融合获杂种菌株

以有自然标记的双核风尾菇(Pleurotus sajor-caju)和桃红平菇(P．Rhodophyllus)为出发菌株,以它们携带营养缺陷型标记的单孢菌株为直接亲本,采用BAEKON 2 000基因转移仪进行侧耳属种间原生质体电融合,成功地获得若干株融合体,其中有一株编号为F57的融台体已培育出子实体。比较了融合体F57与亲本的形态、生理、生化和遗传等性状,结果证实,融合体F57是一株新的种间杂种菌株。     

虎仗原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16(44)正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明:1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

原生质体电融合构建酵母多倍体的研究

为考察将STA基因导入酿酒酵母的可能性和研究糖化酵母在不同核倍性下STA基因的表达效应,从酿酒酵母HU-TY-1A及糖化酵母5101-7C、5206-1B、5301-14D出发,通过原生质体电融合技术,构建了11株核倍性分别为2n、4n、5n及8n的酵母多倍体.所用电融合参数为:交变电场强度200v/cm,频率1MHz;电脉冲强度9kv/cm,宽度40μsec,脉冲数2个,间隔10sec,波形为方波.在糖化酵母单一亲株融合组合中,融合株检出采用菌落形态作为初检指标取得一定效果.其它融合组合则采用遗传标记检出更为可靠.所得融合率约为5×10~(-5)—1×10~(-3).所有融合株经15代以上传代培养,遗传稳定.     

空间电融合的烟草原生质体再生植株分析

报告了在"神舟四号"飞船中通过电融合获得的烟草融合细胞,经地面培养获得再生植株。空间飞行样品再生愈伤组织的频率为地面对照的3倍多,而植株再生频率却比地面对照约低20%,约有32%的再生植株可能具有杂种性状。选取叶形状变化最为明显的H23号植株与黄花品种进行回交,回交一代的叶比原始材料宽,花的颜色与亲本黄花品种相同,表明空间微重力环境中融合的烟草原生质体能够再生植株,获得有繁殖能力的杂种。     

产金属硫蛋白酵母菌原生质体电融合研究

采用原生质体电融合技术,由不能水解淀粉、细胞生物量低,只抗Cu²⁺、金属硫蛋白(MT)中cys含量高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,a)单倍体BD101-25和具淀粉水解能力、细胞生物量高、Cu²⁺、Cd²⁺抗性高、金属硫蛋白中cys含量低的异常毕赤酵母(Pichiaamomala,a)单倍体BD102-13获得4个融合株。融合组合有两亲株属间融合和单一亲株种内融合两类。融合株细胞体积、DNA含量均近似于两亲株细胞之和,并具有水解淀粉能力,Cu²⁺、Cd²⁺抗性高,细胞生物量高,MT中cys含量高等特点。属间融合株Cu²⁺、Cd²⁺抗性的遗传性状稳定。     

相同交配型酵母原生质体电融合及融合体的分析

本文报道了用电场诱导相同交配型啤酒酵母单倍体菌株原生质体融合。电场诱导的融合率比聚乙二醇(PEG)诱导的融合率高2—4倍。并对融合体进行了分析,融合体的细胞体积约为亲株细胞体积之和,DNA含量也比亲株高,有的为亲株的两倍,有的为亲株的三倍左右,融合体的生物量也比亲株高,如FD－5的生物量约为亲株的三倍,具有一定的生产应用价值。     

原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种

电场诱导酸橙(CitrusaurantitumL.)叶肉原生质体与澳洲指橘(MicrocitruspapuanaSwingle)悬浮系原生质体融合,融合产物经培养再生出具有三种叶片形态的植株,绝大部分与酸橙叶片完全相似(即叶肉亲本型植株);有2棵植株叶片大且厚;有1棵植株出现二叶和三叶。细胞学检查表明这些植株均为二倍体。采用RAPD标记对前两种植株进行杂种特性分析,共选用4个10-mer随机引物进行扩增。在引物OPAA-17的扩增产物中,再生植株的带型与酸橙一致;在引物OPA-08的扩增产物中,再生植株的带型与酸橙或澳洲指橘相似;而在引物OPA-04和OPA-07的扩增产物中,再生植株的带型出现三种情况,4个引物的扩增结果证明所分析的植株均是体细胞杂种。综合染色体检查和RAPD标记的结果,表明获得了酸橙与澳洲指橘属间二倍体体细胞杂种植株。     

基于微电极阵列的微生物电融合

利用自主研制的梳状交叉微电极阵列细胞电融合芯片系统,研究微生物电融合。在酶解浓度1．5％、酶解温度33℃、酶解时间3h、酶解pH值6．0、0．8mol／L山梨醇的渗透压条件下,获得生成率和再生率分别为95．2％和8．9％的微生物细胞原生质体。在脉冲峰值电压50V、持续时间80μs、8个脉冲、间隔1s的电融合条件下,该原生质体通过电融合获得一株菌株其乳化性能从62％提高到85％。     

原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种

Leaf derived protoplasts of Sour orange (Citrus aurantium L.) were fused electrically with embryogenic protoplasts of Microcitrus papuana Swingle. Plants were regenerated from the fusion products, which were characteristic with three types of leaf morphology. Most of the plants were identical to Sour orange (namely, Leaf-parent-type plant) and two plants had large and thick leaves whereas one plant had bifoliate and trifoliate leaves. Chromosome examination showed that these plants were diploid with 18 chromosomes (2n = 2x = 18). RAPD analysis was employed to verify the hybrid characteristics of the plants in the first two types. Four 10-mer arbitrary primers with polymorphism were chosen. Band pattern of the plants was similar with the leaf parent (Sour orange) for the primer OPAA-17. Band pattern of the plants was similar with either Sour orange or M. papuana for OPA-08. As for OPA-07 and OPA-04 three kinds of band profiles were detected. Results of RAPD marker, together with chromosome determination, indicated that all of the analyzed plants were intergeneric diploid somatic hybrids between Sour orange and M. papuana.     

植物细胞电融合技术在空间实验中的应用

细胞电融合是实用性很强的生物技术,然而在地面上由于重力沉降和热对流的影响,杂种细胞融合得率较低,使得这项技术在生产上的应用潜力难以发挥。大量的实验表明,空间微重力环境是实现细胞电融合的重要途径。今后有望利用空间微重力条件获得有价值的杂合细胞,培育作物新品种,为开展空间生物加工和空间制药提供良好基础。