GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化北大核心

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

荧光素酶基因luc在大肠杆菌中表达条件优化

对重组荧光素酶大肠杆菌菌株M15／pQE30-luc进行了表达条件的优化研究。单因素结果表明：在初始pH值7．0,装液量为20％,2％的接种量,终浓度为0．5mmol／L的IPTG,添加10—30mmol／L的Mg^2＋,摇床转速为200r／min,37℃诱导3．5h酶的表达量最高。正交试验结果表明：初始pH值为7．0,添加40mmol／LMg^2=,接种量2％,装液量为20％时表达量最高,比酶活达1．63×10^8RFU／mg蛋白。     

249个氨基酸的人胰岛素原融合蛋白的表达

选Tac启动子,构建了以牛凝乳酶原B前161个氨基酸的多肽基因与人胰岛素原基因的融合基因的表达质粒pJG202,转化大肠杆菌JMl05,表达受IPTG及温度诱导。高表达时,按电泳扫描计算,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白的20－35％。经CNBr裂解,S－磺酸解,初步分离S－磺酸型的人胰岛素原后再使之重组,可分离得人胰岛素原纯品,其氨基酸组成、生物活性与人胰岛素原标准相同。     

重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB发酵条件优化

基因工程法能够简便易行的合成重组芋螺毒素,发酵条件会影响其表达产量。为获得高效表达,采用单因素试验法优化基因工程大肠杆菌的发酵条件如发酵时间、IPTG浓度、初始pH和发酵温度等。利用蛋白定量试剂盒测定表达上清总蛋白量,并用Tricine-SDS-PAGE电泳分离后灰度扫描分析重组芋螺毒素的含量。实验结果获得最佳发酵条件:发酵时间为4 h,IPTG浓度为0.4 mmol/L,培养基初始pH为6.0,发酵温度为26℃,优化后表达量为19.4 mg/L,研究结果为大规模生产芋螺毒素MrVIB奠定了坚实的基础。     

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分（g／L）：碳源I 15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源I5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7．0～7．5,将18h菌龄的种子培养液按10％接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度（28±1）℃、摇床转速180r／min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝扣蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率迭3．9g／100mL,蛋白激发子产量达到5．17g／L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。     

探索不同培养条件对大肠杆菌表达蛋白的影响

应用基因工程技术,在获得表达脱落酸受体蛋白PYL10的重组大肠杆菌菌株后,研究了表达时长、表达温度和诱导剂浓度对蛋白PYL10表达的影响。在22℃时加入200μmol/L IPTG时,设置变量诱导时间分别为0h、1h、2h、4h、8h、16h,结果发现诱导时长为16h时PYL10的表达量最高;其他条件相同时,探索诱导温度为4℃、15℃、22℃、37℃后发现在22℃下PYL10的表达量最高;同样,保持其他条件相同,改变IPTG浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)发现,在加入200μmol/L IPTG时PYL10的表达量是最高的。     

不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过E     

藻红蛋白的高效异源生物合成及其生物活性

[目的]实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。     

不同培养条件对抗a毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对SvFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和0.4mol/L蔗糖。37℃诱导6h,其目的蛋白 表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量在31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和a毒素的活性。     

地龙蛋白对人增生性瘢痕细胞增殖抑制作用机制研究

目的:研究地龙蛋白对人增生性瘢痕细胞增殖抑制作用机制。方法:培养人增生性瘢痕成纤维细胞(HSF),将传代好的HSF细胞分为四组,分别加入地龙样品浓度为0 mg/m L(对照组)、0.3125 mg/m L(低剂量组)、0.625 mg/m L(中剂量组)、1.25 mg/m L(高剂量组)。应用MTS法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法和Western-blot法测定Cyclin D1、Caspase-3、TGF-β1的表达,Western-blot法测定Bcl-2、Mcl-2的表达。结果:地龙蛋白对HSF细胞的增殖活力有抑制作用。浓度0.625mg/m L、1.25 mg/m L样品组作用细胞48 h后凋亡率为分别为31.5%和69.2%,(P0.01);RT-PCR显示,浓度0.625 mg/m L、1.25mg/m L样品组能够增加Caspase-3的基因表达,降低Cyclin D1的基因表达,降低TGF-β1的基因表达,(P0.01);浓度0.3125mg/m L样品组与空白对照组比较有显著性差异(P0.05)。W-B方法显示,各样品组能够增加Caspase-3的蛋白表达量,降低Cyclin D 1的蛋白表达量,降低TGF-β1的蛋白表达量,(P0.01);浓度0.625 mg/m L、1.25 mg/m L样品组能够降低Bcl-2蛋白表达量,(P0.01);浓度0.3125 mg/m L样品组Bcl-2的蛋白表达量与空白对照组比较有显著性差异(P0.05)。结论:地龙蛋白诱导细胞死亡,作用机制与下调Cyclin D1的基因和蛋白表达,上调Caspase-3的基因和蛋白表达,下调TGF-β1的基因和蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达量有关。     

采用正交设计优化HPV16L1重组蛋白表达的实验研究

通过正交试验对构建的人乳头瘤病毒（HPV）16型L1蛋白的重组表达菌株pQE31—HPV16L1／M15（pREP4）进行表达条件的优化,以增加目的蛋白的表达量。实验选取影响蛋白表达的4个主要因素,分别为诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度和诱导温度,采用四因素两水平正交试验,通过SDS-PAGE及Western blot测定重组表达蛋白,以Tanon凝胶成像系统分析目的蛋白含量作为检测条件优化效果的指标,所得数据采用SAS软件进行统计分析。实验结果表明在37℃、IPTG0．5mmol／L,菌密度OD600为1．0的条件下诱导4h所得蛋白量最大;经统计正交分析的最佳诱导条件为37℃、0．5mmol／LIPTG和菌密度OD600为1．0的条件下诱导7h。经实验验证,应用正交分析的最佳条件诱导所得目的蛋白量最大,但实际中通常采用诱导4h条件。实验证明正交试验可以用于基因工程菌株蛋白表达条件优化过程,提高工作效率。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

固定化啤酒酵母废菌体吸附Pd2+的研究

用2％海藻酸钠与l％明胶混合为包埋剂固定啤酒酵母废菌体。SEM、X-射线能谱和TEN研究结果表明,该固定化啤酒酵母废菌体(ISCWB)颗粒中的菌体分布较均匀,ISCWB不仅能吸附Pd^2 ,而且能将Pd^2 还原成Pd^0。ISCWB吸附Pd^2 的最适pH值为3．5。在30℃～70℃范围内,吸附作用不受温度的影响。吸附作用是一个较快的过程,在最初的5min内吸附量可达最大吸附量的36％。吸附作用受ISCWB浓度、Pd^2 起始浓度和共存离子的影响。在起始Pd^2 浓度100mg/L,ISCWB浓度1．8g/L、pH3．5和30℃条件下振荡吸附90min,吸附量为40．6mg/g.以0．5mol／L盐酸作为解吸剂解吸率达98．7％。连续吸附与解吸附试验结果表明,ISCWB的最大饱和吸附量为46．3mg/g,解吸率为98％。     

牛凝乳酶的结晶及其二硫键的化学修饰

为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg／ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃1．4—2．0mol／L氯化钠条件下进行培养可以获得外形近似为正立方体晶体。化学修饰的结果证明,凝乳酶的三对二硫键处于酶分子不同的空间部位。0．72mmol／L DTT在Ph6．3条件下能还原处于分子表面的一对二硫键,经溴化氰降解分肽测定为Ｃys²⁵⁰-Cys²⁸³,还原后引起活力下降25％。在二硫键之间引入汞原子其活力与还原酶,羧甲基化酶的活力大体相同,说明Cys²⁵⁰-Cys²⁸³在维持凝乳酶具有活力的空间构象中起着一定的作用。     

培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响

以Bs＋0．5mg／L NAA＋0．5mg／L BA为基本培养基,研究了B5培养基中8种主要无机盐浓度对杜仲愈伤组织生长及绿原酸和总黄酮两种次生代谢产物含量的影响。结果表明：在1000～5000mg／L范围内增加培养基中KNO3的含量有利于愈伤组织生长,B5培养基中当KNO3的浓度达到2／3时,绿原酸和总黄酮含量及产量最高;(NH4)2SO4以4／3原浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高,对绿原酸的含量则是其为原浓度的1／3时最高;MgSO4以2／3浓度对生长量及1／3浓度对绿原酸、总黄酮积累最高;NaH2PO4、CaCl2和MnSO4以原浓度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好;ZnSO4和FeSO4的原浓度愈伤组织的生长量最大,而1／3浓度的绿原酸和总黄酮含量最高。     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。