空间细胞电融合关键技术的地基研究——烟草细胞的电融合

本文针对建立空间细胞电融合技术存在的三个主要问题进行了研究。结果表明,用低温(4℃)、融合介质(0.55 mol/L甘露醇)并添加0.1%纤维素酶保存原生质体,72 h内可以使约94%细胞维持无壁状态,同时并未使细胞丧失再生能力,基本满足从地面制备亲本细胞到在微重力条件下进行电融合,对亲本细胞保持无壁状态的要求。为减少剪切力环境对亲本细胞造成的损伤,一方面用超速离心方法对亲本细胞之一去液泡,另一方面用电泳代替蠕动泵混合亲本细胞。而且,由于原生质体壁生长与其膜电位之间存在负相关性,因此利用电泳方法可以有效地富集和优化亲本细胞。根据地面实验结果推测,空间有/无液泡亲本细胞电融合的较适合参数可能为:交流电场强度90V/cm,频率0.8 MHz,排列时间20 s,直流脉冲1.0—1.3 kV/cm,幅宽40μs,两次脉冲。     

兔2—细胞胚胎电融合及其融合胚体外发育的研究

本文对兔２－细胞胚胎卵裂球电融合制作四倍体胚胎的适宜条件进行了研究。电场强度为２．０千伏／厘米,脉冲时程为４０微秒时,可获得最好的融合率（６８．９－１００％,平均为７７．３％）及融合胚发育率（７４．５％）,该发育率与受精卵体外囊胚发育率（７９．３％）相似。对于电融合及融合胚发育,非电解质溶液（０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋０．１ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钙＋０．１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁）优于电解质溶液。融合后,７２．     

细胞电融合技术及最新进展

细胞电融合（cell electrofusion）是一种发展迅速的细胞工程技术,在细胞融合研究领域得到了最广泛的应用。细胞电融合利用细胞在相对电极之间的介电电泳,诱导细胞按特定方向排列,通过电极间产生的较高场强的电脉冲使相互接触的细胞发生电穿孔,进而发生电融合。融合后的细胞得到了不同细胞的遗传物质,具有新的遗传或生物特性。目前,细胞电融合技术对生物医学、农业等相关领域的研究具有非常重要的意义。本文介绍了细胞电融合技术及其最新研究动态,并简单介绍了本实验室在该领域的研究进展。     

基于微电极阵列的微生物电融合

利用自主研制的梳状交叉微电极阵列细胞电融合芯片系统,研究微生物电融合。在酶解浓度1．5％、酶解温度33℃、酶解时间3h、酶解pH值6．0、0．8mol／L山梨醇的渗透压条件下,获得生成率和再生率分别为95．2％和8．9％的微生物细胞原生质体。在脉冲峰值电压50V、持续时间80μs、8个脉冲、间隔1s的电融合条件下,该原生质体通过电融合获得一株菌株其乳化性能从62％提高到85％。     

柑橘细胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再生

以“Ｐａｇｅ”橘柚（ＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａＢｌａｎｃｏ×Ｃ．ｐａｒａｄｉｓｉＭａｃｆ）胚性悬浮系原生质体和粗柠檬（Ｃ．ｊａｍｂｈｉｒｉＬｕｓｈ）叶肉原生质体为融合试材,摸索了适合柑橘的电融合参数。研究表明,在ＡＣ（交变电场）１２５Ｖ／ｃｍ、ＤＣ（直流脉冲）１２５０Ｖ／ｃｍ、ＡＣ作用时间６０ｓ、ＤＣ脉冲时间５０μｓ、ＤＣ脉冲个数为３、ＤＣ脉冲间隔为０．５ｓ时融合率较高,双核异核体率可以达到１５％以上。利用不同类型原生质体比重的不同,融合后通过控制离心时间,可以收集到更高比例的双核异核体。融合产物经培养,３～４个月再生小植株。染色体计数结合形态学观察表明,再生的１５０株小植株中７８％为四倍体,其余为二倍体叶肉亲本再生类型。再生植株经过氧化物酶同工酶及ＲＡＰＤ分析,表明得到了体细胞杂种,还证明获得了１株叶肉亲本同源四倍体再生类型。     

小鼠电融合四倍体胚胎早期发育的研究

多倍体发育现象在低等动物,尤其是在无脊椎动物中比较普遍,在哺乳动物中多倍体往往发育到胚胎早期就死亡,因而在自然界中不能存活。探讨哺乳类四倍体不能存活的原因是当今生物学研究的热点问题之一。目前,电融合技术是大量获得四倍体胚胎的主要手段。本以8－12周龄昆明小白鼠为实验对象,取其2－细胞胚胎于Whitten氏液中进行电融合,再移入CZB液中培养。电刺激的条件分别为：1．0kv/cm,40μs,和0．8kv/cm,80μs。对融合胚发育的状态、细胞数目及染色体组成等进行观察的结果表明,融合胚培养24小时后发育到4－细胞期,并发生致密化（Tab.1)。融合胚的囊胚形成时间与体内发育的同期胚胎及体外培养的同期二倍体胚胎基本一致（Tab,2;Fig.1)。融合囊胚的细胞数平均为13．0±4．95,显（P＜0．01）少于体外发育囊胚（37．0±5．92）和体内发育囊胚（41．6±2．4）的细胞数（Tab.3)。融合胚各个分裂相的染色体数目分布情况见Fig.2,其四倍体（4n＝80）率为42．86％,非整倍体率达57．14％。而对照组的体内发育囊胚的非整倍体率仅为11．54％;（Tab.4),与Kaufman的结果（12．4％）很接近,说明本实验中的染色体制备技术和分析方法是可行的。融合囊胚的细胞数目减少和高发的非整倍体率可能是四倍体胚胎发育能力差的原因。     

大鼠壁细胞基底膜容积致敏感氯通道电流

为研究胃粘膜壁细胞容积致敏感氯通道电流的定位、电生理特征及药物效应并推断其在壁细胞病理生理过程中所起作用,对急性分离的大鼠胃粘膜壁细胞进行全细胞膜片钳记录,将电极液设置为高渗（Δ≈７０ｍＯｓｍ）,使细胞出现稳定的体积增大后,在其基底膜上记录到容积致敏感氯通道电流（ｖｏｌｕｍｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｃｕｒｅｎｔ,ＶＳＣｌＣＣ）,该电流具有外向整流性及电压和时间依赖性,可被１０μｍｏｌ／Ｌ花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ,ＡＡ）可逆性抑制（７１．３±１０．９％）。细胞外液ｐＨ值由７．４降低至４．０,ＶＳＣｌＣＣ的幅度显著下降（６３．１±１４．０％）,而其激活及失活动力学无改变;ｐＨ升高至９．０对ＶＳＣｌＣＣ无影响。壁细胞ＶＳＣｌＣＣ对细胞内外钙离子浓度均呈现明显的依赖性。结果表明,壁细胞基底膜上存在本底氯通道和容积致敏感氯通道两种不同的氯离子通道。ＶＳＣｌＣＣ可能参与某些胃粘膜疾病的病理生理过程。     

一种改进的杂交瘤细胞电融合方法

一种改进的杂交瘤细胞电融合方法邹翔（南京大学医学院南京２１０００８）刘琴芝,裴红英,郁文芳,安节,陈伯权（中国预防医学科学院病毒学研究所北京１０００５２）陈刚,赵南明（清华大学生物科学与技术系生物膜与膜生物工程国家重点实验室北京１０００８４）我们对国...     

细胞电融合技术在空间的发展潜力

以杂交瘤细胞生产和植物体细胞杂交为例，就发展空间细胞电融合技术问题的提出、技术关键、面临的挑战和在空间的发展潜力进行了分析。指出从国外研究结果来看，细胞电融合技术有可能发展成为未来的空间生物加工技术。     

鱼类细胞电融合的初步研究

电融合是一种细胞生物学新技术,它的融合率高、操作简便、无毒性、可在显微镜下直接观察融合过程,是细胞杂交与基因转移的有效手段之一。近几年来,这一技术已广泛用于动物、植物、微生物细胞和原生质体的融合1～4。但是,至今未见有电场诱导鱼类细胞融合的研究报道。我们采用国产元、器件,研制出一套供试验用的电融合装置,研究了电场诱导鱼类细胞的融合效应。       

烟草和枸杞属间原生质体电融合再生杂种植株

烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）叶肉原生质体和枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ．）悬浮细胞原生质体在适宜电场条件下能以４％ —５％ 的频率发生异质融合。用过氧化物酶和超氧歧化酶同工酶方法对随机选取的１００ 个细胞系进行分析,发现杂种愈伤组织形成频率为９％ 。其中５个杂种细胞系具有分化能力,再生出大量丛生小苗。这些小苗多数在形态上兼有双亲特征并难以生根和长大。叶片酯酶同工酶分析表明,其中２ 个杂种细胞系（ＮＬ４ 和ＮＬ８）再生苗含有一条双亲没有的重组酶带。对亲本和杂种细胞系ＮＬ４ 的细胞学观察结果表明,杂种细胞系的染色体数目为２ｎ＝ ５５—８０,明显高于亲本。对亲本及ＮＬ４ 和ＮＬ８ 愈伤组织的基因组ＤＮＡ 进行ｒＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交发现,ＮＬ８ 含有双亲的全部谱带,且在３．０ ｋｂ 处出现１ 条新带;ＮＬ４ 没有枸杞的特征带,但在３．０ ｋｂ 和５．５ ｋｂ 处出现２ 条新带,说明这两个杂种中的双亲ｒＤＮＡ 可能已发生分子间重组。从ＮＬ４ 愈伤组织得到４ 株形态上近似烟草的完整植株,并移栽成活     

哺乳动物细胞电融合技术及其影响因素的研究进展

细胞电融合技术是指利用电脉冲促使两个或更多个不同的细胞融合在一起的过程。由于可以获得较高的融合率,而且可以在显微镜下定向诱导细胞融合和直接挑选杂种细胞,故电融合技术得到了广泛的应用。电融合技术对于哺乳动物杂种细胞的构建;哺乳动物四倍体发育的研究;以及胚胎细胞核移植都具有十分重要的意义。因此,人们对哺乳动物的电融合问题进行了大量的研究,现将这方面的研究进展做一综述。 (一)电融合技术的原理及方法 悬于平行电极之间的低电导率溶液中的细胞,在适当强度与持续时间的直流电脉冲的刺激下,其细胞膜可发生可逆电击穿,此时如两个具有膜微孔的细胞紧穿接触,可导致细胞质桥的形成,进而发生细胞融合。     

影响细胞电穿孔效率的因素

根据细胞电穿孔的原理和细胞电融合仪的性能,将细胞电融合仪用于细胞电穿孔,使Cos－7,Vero和Namalwa等三株细胞都得到了转染。转染率分别达到外43％,0．42％和1．66％。通过β－半乳糖苷酶组织化学染色确定转移基因的表达,建立了一种快速优化电转染参数的方法。该方法只须改变电压一个参数,全部实验可以在一天内完成,该方法较之其它转染方法（如磷酸钙沉淀法,脂质体法,DEAE－葡聚糖法以及逆转录病毒介导转染法）具有可重复性强,经济便宜以及适用于多种细胞系的特点。     

鱼类囊胚细胞和卵的电融合

细胞核移植是研究细胞分化、核质关系等有效手段,已取得了较好的成绩。但由于细胞核移植是一种显微操作技术,技术难度较大,尚难以普及与推广。我们在进行鱼类细胞电融合初步成功的基础上,开展了鱼类囊胚细胞和未受精卵的电融合研究,探讨电脉冲可逆击穿能否将外源细胞核引入卵内?以及外源细胞核能否促进未受精卵分裂、发育成正常的个体?       

香菇和侧耳属间原生质体的电融合研究

从培养在液体培养基中的香菇、美味侧耳和平菇的单核菌丝用酶法分离了原生质体。施加0.5MHz、500PV/cm的正弦波和μs、6000PV/cm方形脉冲的电场诱导下使其电融合。电融合后的融合子和原生质体在固体培养基上植板培养成菌落。在显微镜下检查融合子菌株菌丝的锁状联合选出从融合子长成的菌株。香菇和美味侧耳的融合菌株产生频率为61.53%,香菇和平菇的融合菌株产生频率为32.58%。根据融合菌株与亲本的拮抗作用和他们的过氧化物同工酶和酯酶同工酶的电泳酶谱与其亲本酶谱的不同,证实这些融合菌株是从融合的异核体生长成的。同时讨论了电融合方法和结果。     

离子浓度对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响

四倍体胚胎的制备已经成为生物学家研究小鼠以及其它哺乳动物发育生物学的有力工具。目前,制备小鼠四倍体胚胎最常用的方法是电融合法,其中电融合液中的离了种类和离子浓度是影响胚胎电融合成败的关键因素。本文比较了Ca^2＋、Mg^2＋、Sr^＋、Na^＋、K^＋、Li^＋等阳离子对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响。结果发现,在100V／mm电场强度、50μsec脉冲时程和2次脉冲的电融合条件下,少量二价阳离子的存在是胚胎融合所必须的,当Ca^2＋为0．1mM时,可使全部胚胎发生电融合,而一价阳离子的存在不利于胚胎的电融合。随着各种离子浓度的大幅升高,胚胎的融合率急剧下降、胚胎死亡数量增加以及死亡程度加剧。     

运用高效率电融合技术建立抗-hCG杂交瘤细胞株

应用本实验室研制的细胞电穿孔融合仪和平行不锈钢丝多电极小池,以及独立开发的杂交瘤细胞电融合标准程序,对绒毛膜促性腺激素(hCG)免疫的一只Balb c小鼠B淋巴细胞和NSl骨髓瘤细胞进行了电融合.实验以1/5的B细胞进行电融合,共铺96孔培养板536孔,产生317孔杂交瘤细胞克隆,检测出稳定的强阳性克隆22孔;以4/5的B细胞进行了对     

小鼠2—细胞期经电融合后的早期胚胎发育

小鼠２－细胞期经电融合后的早期胚胎发育小鼠,电融合,细胞数,核型,四倍体胚胎小鼠２细胞期经电融合后的早期胚胎发育ＥＡＲＬＹＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＯＦＭＯＵＳＥＥＭＢＲＹＯＳＰＲＯＤＵＣＥＤＢＹＥＬＥＣＴＲＯＦＵＳＩＯＮＡＴ２ＣＥＬＬＳＴＡＧＥ关键...     

植物细胞电融合技术在空间实验中的应用

细胞电融合是实用性很强的生物技术,然而在地面上由于重力沉降和热对流的影响,杂种细胞融合得率较低,使得这项技术在生产上的应用潜力难以发挥。大量的实验表明,空间微重力环境是实现细胞电融合的重要途径。今后有望利用空间微重力条件获得有价值的杂合细胞,培育作物新品种,为开展空间生物加工和空间制药提供良好基础。     

血管内照射（He－Ne）对患者外周血淋巴细胞中凋亡细胞（PCD）的影响

本文报道了用氦氖激光血管内照射（ＩＬＩＢ）治疗九例患者过程中,应用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞中凋亡细胞的发生,结果提示,照射后凋亡细胞百分率为（６．４３±５．０７％）与照射前比较（０．３８±０．５３％）,ｐ＜０．０５。