辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）启动子分离及序列分析

根据已知的辽宁碱蓬BADH cDNA 5′端序列设计两个基因特异的反向引物（BR1,BR2）,通过衔接头PCR获得了BADH基因起始密码子上游265 bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物（BR3,BR4）,用BR2、BR3、BR4分别与4个简并引物配对,通过TAILPCR扩增,获得了约2 kb 的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了BADH基因起始密码子上游2055 bp的序列。用TSSPTCM软件分析此序列,预测出转录起始点（T）位于起始密码子上游62 bp处,由此获得了1993 bp的SlBADH启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATAbox、CAATbox,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件CANNTG,伤害诱导元件ANATTNCNN,热激元件ATAAATGT等,是一个强的胁迫诱导启动子。     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)基因启动子分离及功能元件分析

根据已知的辽宁碱蓬CMO cDNA 5′端序列设计两个基因特异的反向引物(CR1,CR2),通过衔接头PCR获得了CMO基因起始密码子上游498 bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物(CR3,CR4),用CR2、CR3、CR4分别与4个简并引物配对,通过TAIL-PCR扩增,获得了约2 kb的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了CMO基因起始密码子上游2,332 bp的序列。用TSSP-TCM软件分析此序列,预测出转录起始点(C)位于起始密码子上游128 bp处,由此我们获得了2,204 bp的SlCMO启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,冷胁迫诱导元件CANNTG,ABA 响应因子NAACAA,水胁迫元件CGGTTG和伤害诱导元件GTTAGGTTC等,是一个强的胁迫诱导启动子。辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因盐诱导启动子的获得,为盐诱导启动子功能元件分析提供了可能,为进一步研究启动子结构与功能的相互关系、CMO基因的表达调控机制奠定了基础。     

盐角草磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（SePEAMT）启动子的克隆及瞬时表达

磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5'端序列设计两个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明：该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件（如ABRE、HSE、LTR）和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS 融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。     

绿豆种子8S球蛋白基因启动子的克隆及分析

根据绿豆种子8S球蛋白α'亚基基因的末端序列设计3个特异反向引物.以绿豆基因组DNA为模板,采用基因组步移法,获得了8S球蛋白α'亚基基因起始密码子上游784 bp的DNA片段,通过序列测定和生物信息学分析,发现该序列含有启动子核心区以及大量的种子特异表达相关的顺式作用元件,表明此序列为种子特异启动子序列.通过PCR方法在启动子3'端加上翻译增强序列TMV-omega序列,构建了植物双元表达载体pBI-8SG α'-omega-gus,并成功将其转化进入农杆菌.     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物(GSP-1,GSP-2,GSP-3)分别与11个简并引物(AD1-AD11)配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG,在真空条件下通过农杆菌介导,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织,Gus瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有种子特异的启动子活性?对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的 5 '端序列设计三个基因特异的反向引物 (GSP-1,GSP-2 ,GSP-3)分别与 11个简并引物 (AD1-AD11)配对 ,进行热不对称嵌套PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR ,TAIL-PCR)扩增 ,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性 ,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG ,在真空条件下通过农杆菌介导 ,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织 ,Gus瞬时表达染色结果显示 ,该DNA片段具有种子特异的启动子活性。对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

麻疯树苯丙氨酸解氨酶启动子的克隆和表达载体的构建

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）是苯丙烷类代谢途径的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生成。本文根据已克隆的麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因JcPAL的序列设计引物,通过DNA步移技术,克隆出长度为1 334 bp的JcPAL基因起始密码子上游序列。序列分析显示其不仅具备CAAT、TATA盒这些保守元件,而且包含多种胁迫诱导元件,特别是在序列中发现一些苯丙氨酸解氨酶特有的元件。为了鉴定JcPAL基因的启动子元件,分别将长度不同的5′端侧翼区缺失体定向插入载体pBI121中, 取代原有的CaMV35S启动子,构建了4个驱动报告基因GUS的植物表达载体。     

小麦TaPSG719基因启动子的分离及序列分析

TaPSG719基因是从小麦中分离的花粉特异性表达基因,其功能未知。克隆和分析该基因的启动子有助于研究该基因的功能,解析小麦花器官的发育调控机制。本研究根据已报道的TaPSG719基因cDNA序列为基础设计引物,经过两次反向PCR获得了该基因起始密码子上游1776bp的调控序列。应用PLACE和PlantCARE数据库系统对该序列进行分析研究,发现其具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box、两种花粉特异性调控元件AGAAA和GTGA及光反应和激素响应元件。     

一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3'末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列,设计一条基因特异性引物,与通用引物并用,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端。与常规的3′RACE法相比,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点,是一种非常快捷的扩增cDNA 3′末端序列的方法。 Abstract:Based on part of a known cDNA sequence of Suaeda liaotungensis betaine aldehyde dehydrogenase,we successfully cloned the 3′cDNA end of S.lianotungensis betaine aldehyde dehydrogenase using one step PCR with a gene specific primer and universal primer.Compared with the typical 3′ RACE,one step PCR is rapid,simple and inexpensive.It is very rapid to amplify an unknown cDNA 3′end using this method.     

盐生植物盐爪爪甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及在盐胁迫下的BADH基因的表达

根据已发表的几种藜科植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计了一对引物,采用RT-PCR方法从盐生植物盐爪爪(Kalidium foliatum)中扩增出BADH基因的1个开放阅读框架,其核苷酸序列长1503bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基。核苷酸序列与藜科几种盐生植物如滨藜、碱蓬、菠菜、山菠菜和甜菜等的同源性为81%,与甜土植物水稻的同源性为69%。氨基酸序列与以上两类植物(盐生植物和甜土植物)的同源性比对为80%和71%,说明BADH基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。BADH基因编码的多肽在高等植物中行使重要的功能。用不同浓度的NaCl胁迫处理盐爪爪植株,BADHmRNA的表达水平比对照植株高,说明盐爪爪BADH基因的表达受盐诱导,间接说明甜菜碱醛脱氢酶催化合成的甜菜碱作为渗透调节的小分子物质,它的积累与盐胁迫存在紧密关联,本研究为进一步从生理和分子水平阐明盐爪爪的耐盐机制提供一定的参考。     

盐生植物盐爪爪甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及在盐胁迫下的BADH 基因的表达

根据已发表的几种藜科植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH) 基因的同源保守区设计了一对引物, 采用RT-PCR 方法从盐生植物盐爪爪( Kalidium foliatum) 中扩增出BADH 基因的1 个开放阅读框架, 其核苷酸序列长1 503 bp , 推测的氨基酸序列全长为500 个氨基酸残基。核苷酸序列与藜科几种盐生植物如滨藜、碱蓬、菠菜、山菠菜和甜菜等的同源性为81% , 与甜土植物水稻的同源性为69%。氨基酸序列与以上两类植物(盐生植物和甜土植物) 的同源性比对为80% 和71% , 说明BADH 基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。BADH 基因编码的多肽在高等植物中行使重要的功能。用不同浓度的NaCl 胁迫处理盐爪爪植株, BADH mRNA 的表达水平比对照植株高, 说明盐爪爪BADH 基因的表达受盐诱导, 间接说明甜菜碱醛脱氢酶催化合成的甜菜碱作为渗透调节的小分子物质, 它的积累与盐胁迫存在紧密关联, 本研究为进一步从生理和分子水平阐明盐爪爪的耐盐机制提供一定的参考。     

Selection, mapping, and characterization of osmoregulatory mutants of Escherichia coli blocked in the choline-glycine betaine pathway.

Osmotically stressed Escherichia coli cells synthesize the osmoprotectant glycine betaine by oxidation of choline through glycine betaine aldehyde (choline----glycine betaine aldehyde----glycine betaine; B. Landfald and A.R. Str?m, J. Bacteriol. 165:849-855, 1986. Mutants blocked at the level of choline dehydrogenase were isolated by selection of strains which did not grow at elevated osmotic strength in the presence of choline but grew when supplemented with glycine betaine. A gene governing the choline dehydrogenase activity was named betA. Mapping by P1 transduction, F' complementation, and deletion mutagenesis showed the betA gene to be located at 7.5 min in the argF-codAB region of the chromosome. Mutants carrying deletions of this region also lacked glycine betaine aldehyde dehydrogenase activity and high-affinity uptake activity for choline; these deletions did not influence the activities of glycine betaine uptake or low-affinity choline uptake, both of which were osmotically regulated.     

Compatibility of glycinebetaine in rice plants: evaluation using transgenic rice plants with a gene for peroxisomal betaine aldehyde dehydrogenase from barley

Glycinebetaine is synthesized in plants by the two‐step oxidation of choline, with betaine aldehyde as the intermediate. The reactions are catalyzed by choline mono‐oxygenase and betaine aldehyde dehydrogenase. Rice plants, which do not accumulate glycinebetaine, possess a gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase, whose activity is detectable at low levels. To evaluate the compatibility in rice of glycinebetaine on growth and tolerance to salt, cold and heat, we produced transgenic rice plants by introduction of a cDNA for betaine aldehyde dehydrogenase of barley, which is localized in peroxisomes unlike the chloroplast‐specific localization of betaine aldehyde dehydrogenase in spinach and sugar beet. The transgenic rice plants converted high levels of exogenously applied betaine aldehyde (up to 10 mol m^–3) to glycinebetaine more efficiently than did wild‐type plants. The elevated level of glycinebetaine in transgenic plants conferred significant tolerance to salt, cold and heat stress. However, very high levels of glycinebetaine, resulting from conversion of applied betaine aldehyde to glycinebetaine or from exogenous application, inhibited increases in length of rice plants but not increases in dry weight. Our results suggested that the benefits of accumulation of glycinebetaine by rice plants might be considerable under high light conditions.     

Purification and characterization of osmoregulatory betaine aldehyde dehydrogenase of Escherichia coli

The osmoregulatory NAD-dependent betaine aldehyde dehydrogenase (betaine aldehyde:NAD oxidoreductase, EC 1.2.1.8), of Escherichia coli, was purified to apparent homogeneity from an over-producing strain carrying the structural gene for the enzyme (betB) on the plasmid vector pBR322. Purification was achieved by ammonium sulfate fractionation of disrupted cells, followed by affinity chromatography on 5'-AMP Sepharose, gel-filtration and ion-exchange chromatography. The amino acid composition was determined. The dehydrogenase was found to be a tetramer with identical 55 kDa subunits. Both NAD and NADP could be used as cofactor for the dehydrogenase, but NAD was preferred. The dehydrogenase was highly specific for betaine aldehyde. None of the analogs tested functioned as a substrate, but several inhibited the enzyme competitively. The enzyme was not activated by salts at concentrations encountered during osmotic upshock, but it was salt tolerant, retaining 50% of maximal activity at 1.2 M K+. It is inferred that salt tolerance is an essential property for an enzyme participating in the cellular synthesis of an osmoprotectant.