L-茶氨酸通过乙酰胆碱受体多巴胺奖赏通路抑制尼古丁依赖

本文研究了L-茶氨酸对尼古丁依赖的抑制作用及其机理.采用小鼠条件性位置偏爱实验(CPP)评价发现,L-茶氨酸能够明显抑制尼古丁诱导的小鼠偏爱行为和SH-SY5Y细胞的兴奋状态,而且与尼古丁抑制剂二氢-β-刺桐(DHE)类似.HPLC电化学检测、蛋白质印迹法和免疫荧光染色发现,L-茶氨酸处理能够明显抑制尼古丁引起的小鼠中脑多巴胺水平和酪氨酸羟化酶(TH)的升高,还能够减少与奖赏通路相关脑区的3种尼古丁乙酰胆碱受体(nAChRs)亚基4,2和7及c-Fos表达的增加,从而可能使对尼古丁刺激产生效应的细胞数目减少.另外,L-茶氨酸处理抑制了尼古丁引起的小鼠相关脑区的c-Fos表达的增加.siRNA转染发现,敲除c-Fos基因能够抑制SH-SY5Y细胞兴奋状态但不影响TH的表达.本实验表明,L-茶氨酸可能通过尼古丁引起的乙酰胆碱受体多巴胺奖赏回路抑制尼古丁成瘾,该结果为祛除吸烟成瘾和戒烟策略提供了科学依据.     

PPK和GMAS共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用

构建了共表达ATP再生和L-茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株,并将其应用于L-茶氨酸的合成中。合成多聚磷酸盐激酶(PPK)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)基因序列,分别利用p ETDuet-1和p ET-21a(+)载体,构建共表达重组质粒p ETDuet-ppk+gmas和p ET21a-ppk+gmas。将上述两种重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组菌株TPG和APG。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果表明,PPK和GMAS在两种重组菌中均可溶性表达。当用于催化L-茶氨酸合成时,来自APG的GMAS-PPK要优于TPG。利用APG所产的酶进行L-茶氨酸合成,在37℃、p H 7.0条件下,使用催化量ATP可实现L-茶氨酸的摩尔产率为86.0%。该结果一方面扩展了酶法ATP再生系统的应用,另一方面为生物催化合成L-茶氨酸提供了一种有效方法。     

L-茶氨酸新型酶法制备及其催化工艺优化

L-茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主要组成部分,关于其良好的生理活性已有广泛报道。首次报道了来源于Cunnighamella echinulata 9980的L-氨基酰化酶用于高光学纯度的L-茶氨酸的酶法制备。该酶在pH 6.5,底物N-乙酰-DL-茶氨酸浓度为50 mM,且有40 mM CoCl2时催化效果较好。结果表明,在上述条件下,50℃作用12 h得L-茶氨酸22.5 mM,转化率90%。     

大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆

茶氨酸是茶树叶片中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生理药理功能,但迄今仅在蘑菇、蕈和一些山茶科(属)植物中检测到茶氨酸。茶氨酸因有一种独特的风味特色"umami鲜爽味"而被人类营养学广泛研究,并发现合成茶氨酸的植物不仅在植物分类上具有积极意义,而且对于植物资源的有效发掘有巨大经济价值;同时还可以间接去研究茶树中茶氨酸的代谢机理以及茶氨酸合成酶的分离纯化和TS基因的克隆表达。该文运用HPLC、LC-TOF/MS对大别山地区野生幼年与成年油茶根、叶中茶氨酸进行检测,并结合分子生物学手段对油茶中茶氨酸合成酶(theanine synthetase,TS)基因进行克隆与生物信息学分析。结果表明:在幼年的油茶根中检测到茶氨酸,含量为0.08mg·g-1(鲜重),而在幼年的油茶叶片和成年油茶根、叶中均未检测到茶氨酸;在幼年油茶根中克隆出一条长为1 071bp油茶TS基因开放阅读框,其基因序列与茶树谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,AB117934)基因和TS(DD410896)序列的同源性达到98%,氨基酸序列与茶树中GS(AB117934)和TS(DD410896)的相似性高达99%。经生物信息学分析,该序列编码的TS蛋白具有20个磷酸化位点,不存在信号肽序列与跨膜结构,含有卷曲螺旋结构的亲水性细胞质蛋白。该研究将为油茶新经济价值的发掘,为茶氨酸在油茶中合成代谢途径的研究提供一定的理论基础,同时也为进一步研究茶氨酸在茶树中代谢机理提供了新的研究思路。     

纸层析－分光光度法检测茶氨酸

为了满足普通实验室对茶中茶氨酸测定的需要,研究了茶氨酸的纸层析-分光光度检测方法。结果表明,用茚三酮．乙醇水溶液做展层剂,对茶苗根、芽叶和茶叶的水浸提液进行纸层析,能够有效地将茶氨酸与其它氨基酸分离,紫色色斑清晰而均匀。用乙醇溶液洗脱色斑后用分光光度计在570nm比色,在20～70此茶氨酸溶液点样量范围内其含量与吸光度呈线性关系。本方法检出限为0．0057mg·mL-1,测定下限为0．0191mg·mL-1,平均回收率90．28％～115．38％,平均相对标准差1．51％,具有安全、药品种类少和操作步骤简单等特点。     

ZtNH2-HCl和剪切力对茶叶细胞悬浮培养中茶氨酸合成的影响

以婺源绿茶嫩叶愈伤组织为材料,在采用摇床悬浮培养与发酵罐悬浮培养．分析了茶氨酸合成前体盐酸乙胺(ZtNH2-HCl)不同的添加方式和剪切力对培养细胞增长量和茶氨酸合成量的影响。结果显示,发酵罐放大培养取得了与摇床悬浮培养类似的效果;在一个培养周期中,培养细胞茶氨酸积累高峰出现在第20～22天;发酵罐大规模培养时采用桨叶式搅拌器(低剪切力)细胞增长量和茶氨酸合成苗优于标准板搅拌器;添加盐酸乙胺可大幅度提高茶氨酸积累量,先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充,茶氨酸合成最比一次性加入的效果要好。     

利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸

【目的】构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白(GGT)的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统,验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用,并将该体系应用于高效合成茶氨酸的研究。【方法】将该ggt基因和切除信号肽的片段基因(?sp ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中克隆表达。以C.glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为:L-谷氨酰胺∶乙胺为1∶3,酶量为0.06 U/mL。采用底物流加策略高产L-茶氨酸,40 mL的转化体系包含:终浓度为0.9 U/mL的GGT,pH 10,37℃,从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L的L-谷氨酰胺,60 mmol/L的乙胺。【结果】C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-ggt发酵上清液中GGT酶活达到(4.69±0.34)U/mL,C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-?sp ggt只检测到胞内酶活(0.99±0.17)U/mL,说明利用B.subtilis来源的信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为:葡萄糖浓度为10%;IPTG最适添加时间为0 h。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L,转化率为86.9%。【讨论】本文首次实现B.subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中分泌表达,通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。     

γ-谷氨酰转肽酶在大肠杆菌周质空间的双融合表达

设计引物PCR扩增大肠杆菌Escherichia coli DH5α的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)成熟肽的编码基因,利用基因拼接(gene splicing by overlap extension,SOE)技术将其拼接至小分子泛素相关修饰物(the small ubiquitin-related modifier,SUMO)基因的下游,并重组至pET-39b质粒中,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。得到的工程菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,全菌SDS-PAGE分析,得到表观分子量约为97×103的双融合蛋白,DNA测序进一步证实工程菌构建成功。以菌体直接催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸,纸层析法证实该重组酶具有较好的活性,为酶法生产L-茶氨酸奠定基础。     

L-茶氨酸对H_2O_2致L02细胞损伤的保护作用及其机制研究

研究L-茶氨酸对肝细胞损伤的保护作用及其机制。利用H2O2诱导的L02肝细胞损伤模型,分别用MTT法检测细胞存活率、测定LDH、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白表达及Bax/Bcl-2比值的变化,评价L-茶氨酸是否能保护H2O2诱导的肝细胞损伤。结果表明,L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02细胞存活率,减少LDH的渗漏,降低肝细胞凋亡,且L-茶氨酸通过抑制Caspase-3的激活和PARP的切割及Bax/Bcl-2比值的升高而发挥抗凋亡的作用。L-茶氨酸对肝细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

L-茶氨酸对H2O2致L02细胞损伤的保护作用及其机制研究

研究L-茶氨酸对肝细胞损伤的保护作用及其机制。利用H2O2诱导的LO2肝细胞损伤模型,分别用MTT法检测细胞存活率、测定LDH、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白表达7LBax／Bcl-2比值的变化,评价L-茶氨酸是否能保护H2O2诱导的肝细胞损伤。结果表明,L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02细胞存活率,减少LDH的渗漏,降低肝细胞凋亡,且L-茶氨酸通过抑制caspase-3的激活和PARP的切割及Bax／Bcl-2比值的升高而发挥抗凋亡的作用。L-茶氨酸对肝细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

夏季遮阴对茶树茶氨酸合成及其代谢相关基因表达的影响（英文）

为了研究夏季遮阴对茶树茶氨酸代谢途径的影响及对茶树内含物品质的改良作用,本研究以多年实生茶树为研究对象,利用Western blotting检测了夏季遮阴对茶树不同部位中茶氨酸合成酶(TS)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达的影响,确定遮阴有利于嫩叶中TS的表达;随后利用实时荧光定量PCR检测方法探索了茶氨酸代谢途径中相关基因:TS、GS、谷氨酰胺α-酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)以及与氮素吸收和转化密切相关的亚硝酸还原酶(NiR)、精氨酸脱羧酶(ADC),在老、嫩叶中及不同遮阴时期的表达情况。结果表明遮阴有利于嫩叶中TS基因的表达,与叶部氨的再同化作用密切相关的GS、GOGAT和GDH基因均在老叶中有明显增加,而与硝基氮代谢相关的NiR、ADC基因表达在老叶与嫩叶中均明显下降。利用HPLC对遮阴后嫩叶中游离氨基酸含量的检测结果表明,遮阴明显促进茶叶部游离氨基酸总量的提高,其中贡献率最大是茶氨酸。本研究从分子水平上解析了遮阴促进茶叶部茶氨酸积累的调控机制,为今后夏秋茶栽培措施改良和品质改善提供理论基础。     

大规模茶叶细胞悬浮培养茶氨酸合成工艺优化研究

以婺源绿茶为材料进行茶叶愈伤组织悬浮培养,采用正交实验设计进行了大规模茶叶细胞悬浮培养合成茶氨酸工艺条件优化研究。结果显示,NH4+/NO-30.0/60.0mmol/L、K+100.0mmol/L、Mg++3.0mmol/L、H2PO-43.0mmol/L、蔗糖30.0g/L、水解酪蛋白2.0g/L条件下,茶叶细胞生长量(速率)和茶氨酸积累量均达到最高值;提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可延长细胞对数生长期和稳定生长期,从而有利于茶氨酸积累;H2PO-4浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H2PO4-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H2PO4-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K+和Mg++对细胞生长的影响不明显,但影响茶氨酸合成酶活性,维持适量的K+和Mg++有利于茶氨酸积累。先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充,茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。从生产效率考虑,培养周期以19～22d为宜。     

不同培养条件对悬浮培养茶叶细胞生长及茶氨酸合成的影响*

婺源绿茶嫩叶用MS 培养基( 加IBA 2 mgPL, 6-BA 4 mgPL) 进行茶叶愈伤组织悬浮培养, 研究了不同培养条件对茶叶细胞悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示, NH4+PNO3- 110P6010 mmolPL、K+ 10010 mmolPL、Mg2+ 310mmolPL、H2PO4- 310 mmolPL、蔗糖3010 gPL、水解酪蛋白210 gPL 条件下, 茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量均达到最高值; 提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长, 从而有利于茶氨酸积累; H2 PO4- 浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性, 低H2 PO4- 浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值, 高H2PO4- 浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间; K+ 和Mg2+ 对细胞生长的影响不明显, 但影响细胞茶氨酸合成酶活性, 维持适量的K+和Mg2+ 有利于茶氨酸积累。添加盐酸乙胺可大幅度提高茶氨酸积累量, 并且先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充, 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。茶叶细胞生长和茶氨酸积累高峰期在整个培养过程的第19~ 22 天出现, 从生产效率考虑, 培养周期以19~ 22 天为宜。     

茶氨酸制备工艺研究

研究了一种从提取茶多酚后的残留液中提纯茶氨酸的制备工艺;首先通过ZTC+1型天然澄清剂对茶多酚生产废液絮凝处理,随后应用一种特制的弱极性大孔树脂(JAD-1000)对处理液进行初步分离,制备质量分数在50%以上的茶氨酸粗品;结果表明絮凝处理,不仅对蛋白质去除率达80%以上,对果胶等杂质也有很好的去除效果(去除率达32.0%),杂质总去除率达36.2%,同时对茶氨酸的回收率达到98%以上;JAD-1000初步分离可得质量分数在53%以上的茶氨酸,回收率也达到78%以上,醇洗馏份中基本没有茶氨酸。     

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-?2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-?2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)为底物原料, 经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸, 并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究。建立了以恶臭假单胞菌TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源, 反复多次催化底物合成L-半胱氨酸, 并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸, 进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺。采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%, 纯度为99.12%。该方法简单高效, 解决了酶稳定性差不能重复使用, 而固定化酶方法繁琐成本高的问题, 为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。     

茶组植物中茶氨酸和没食子酸的高压液相色谱分析

应用高效液相色谱(HPLC)技术对茶属茶组的6种3变种植物叶中的茶氨酸和没食子酸含量进行定量分析.结果表明,茶氨酸和没食子酸均普遍存在于这几种茶组植物中,二者在大理茶与广西茶中的含量与大叶茶最为接近,野生的大理茶在云南民间亦作为茶叶的原料使用,有悠久的历史,提示大理茶有可能是大叶茶的基源植物之一.     

沉淀法从茶叶中提取茶氨酸

茶叶浸提液分别用1%壳聚糖和D101大孔吸附树脂去杂后,用碱式碳酸铜沉淀茶氨酸。茶氨酸铜盐用1mol/L硫酸解析,分别用H_2S、Ba(OH)_2除去Cu~(2 )、SO_4~(2 )后,浓缩重结晶得到茶氨酸,提取率34%,纯度99．28%。     

用氨基酸分析仪测定茶氨酸

茶氨酸是茶中主要的和特有的氨基酸。除山茶、茶梅等茶科植物外,至今尚未在其它植物中检出。茶叶中茶氨酸的含量甚高,约占游离氨基酸总量的50—70％,直接影响茶树的新陈代谢和茶叶品质。绿茶茶氨酸含量与滋味等级呈正相关,红茶汤味也受茶氨酸     

不同培养条件对悬浮培养茶叶细胞生长及茶氨酸合成的影响

婺源绿茶嫩叶用MS培养基（加IBA 2mg／L,6-BA 4mg／L）进行茶叶愈伤组织悬浮培养,研究了不同培养条件对茶叶细胞悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示,NH4^＋／NO3^- 1．0／60．0mmol／L、K^＋ 100．0mmol／L、Mg^2＋ 3．0mmol／L、H2PO4^- 3．0mmol／L、蔗糖30．0g／L、水解酪蛋白2．0g/L条件下,茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量均达到最高值;提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长,从而有利于茶氮酸积累;H2PO4^-浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H2PO4^-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H2PO4^-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K^＋和Mg^2＋对细胞生长的影响不明显,但影响细胞茶氨酸合成酶活性,维持适量的K^＋和Mg^2＋有利于茶氨酸积累。添加盐酸乙胺可大幅度提高茶氨酸积累量,并且先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充,茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。茶叶细胞生长和茶氨酸积累高峰期在整个培养过程的第19～22天出现,从生产效率考虑,培养周期以19～22天为宜。     

HZ201树脂在新型酶法制备D-茶氨酸中的应用

以新型物质D-茶氨酸的酶法制备过程为研究对象,考察了HZ201(Cl~-)强碱型阴离子树脂在不同温度下吸附情况及动态实验的洗脱流速,研究结果表明:在25℃时,以8 mL/min稀HCl洗脱,分离出D,L-N-乙基海因丙酰胺酶转化产物,经结构鉴定为N-氨甲酰-D-茶氨酸,该新物质收率达71%,为D-茶氨酸的生物法制备提供了新途径。