石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅰ)二元酸产生菌的筛选方法、菌种鉴定及产物分析

微生物能将正烷烃分子两末端氧化成二元脂肪酸。我们设计了应用指示菌筛选产二元酸菌株的方法,并对产短链二元酸之解脂假丝酵母192(Candida lipolytica 192),和热带假丝酵母79(Candida tropicalis 79),用MNNG诱变育种,挑选在十五烷及十三烷 1:13二羧酸培养基上不生长或生长极差,可能是因β氧化受阻而积聚长链二元酸的突变种进行发酵。发酵产物经熔点测定、质谱分析、元素分析、气相色谱和红外光谱分析,证明为α,ω-十三烷1:13二羧酸。发酵产量解脂假丝酵母94为8.1克/升,热带假丝酵母N-15和N-26分别为14克/升和10克/升。 三株指示菌、不动杆菌(Acinetobacter sp)I_7、C_5和C_(11),对一元酸及二元酸的利用有差异,I_7能利用六碳以上二元酸及一元酸,C_5能利用八碳以上二元酸及一元酸,而C_(11)则只能利用一元酸生长。因此可以根据发酵液在这一组指示菌上的反应,筛选短链二元酸的产生菌。对应用指示菌作二元酸定量测定的方法也进行了讨论。     

石油发酵长链二元酸的研究——Ⅲ.热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种生产十三烷1∶3二羧酸的发酵条件研究

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(CO)N22的十三烷1:13二羧酸高产发酵进行了研究。乙醇、可溶性淀粉、尿素、磷酸氢二铵等为较好的碳、氮源,但尿素等氮源的量增加时则完全抑制了二元酸的合成。烷烃发酵的适宜起始pH值在6～7之间,而发酵过程中则以维持pH值在8～8.5为佳。通气量Ks=0.8毫克分子O_2/升/分时,二元酸的产量最高。苯巴比妥和巴比妥酸钠能明显促进二元酸的合成。以乙醇和蔗糖为碳源,结合补料及调节pH,发酵190小时,十三烷1:13二羧酸产量分别达77.2克/升和72.5克/升。热带假丝酵母多倍体变种能氧化从癸烷至十八烷的正烷烃为相应碳链的长链二元酸,但以十三烷1:13二羧酸的产量为最高。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅱ)热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体的诱变育种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79经 MNNG诱变后获得产长链二元酸突变株N—26,十三烷1:13二羧酸产量为10克/升。N-26％用秋水仙碱和樟脑分别诱发产生多倍体细胞 NP_(CO)2和NP_(Oa)18,十三烷1:13二羧酸产量分别提高到17.3克/升和18.3克/升。多倍体NP_(CO)2和NP_(Oa)18的个体大,生长速率快,DNA含量分别为3.2×10~(-6)微克/细胞和4.O×10~(-6)微克/细胞,而 N-26则为1.6×10~(-6)微克/细胞。 多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18对MNNG均较敏感,致死率较N—26高一倍,诱变之总突变频率则较原种高8—10％,以0.25毫克/毫升MNNG处理时正突变频率可提高一倍左右,因此获得高产突变株的机率显著提高。从多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18经0.25毫克/毫升MNNG处理所得高产菌株、NP_(CO)N22和 NP_(Oa)N39,十三烷 1:13二羧酸的产量分别提高到33.5克/升和34.5克/升。 对多倍体高产变种生理特性的初步观察指出多倍体细胞较易为蜗牛细胞壁溶解酶作用生成原生质体,电子显微镜初步观察指出多倍体细胞的细胞壁可能较薄。 离体酶活力的测定指出多倍体变种的三羧酸循环酶系、呼吸链酶系和过氧化氢酶活力增加,因而推测多倍体变种之所以提高长链二元酸的产量可能是由于ATP的供应增加,促进了烷烃的氧化,而过氧化氢酶的增加可能是对于烷烃氧化过     

肉毒碱乙酰转移酶基因敲除对长链二元酸生产代谢过程的影响

在利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的过程中 ,脂肪酸将进入 β 氧化途径 ,代谢产生能量 ,从而降低产物收率。首次以负责运输的肉毒碱乙酰转移酶为改造目标 ,在肉毒碱乙酰转移酶基因中插入潮霉素B抗性基因 ,构建DNA转化质粒 ,并进行一次同源重组 ,得到肉毒碱乙酰转移酶基因单拷贝敲除的基因工程菌。根据摇瓶实验结果 ,该基因工程菌与原始菌株相比 ,十三碳二元酸的产量与摩尔转化率分别提高了 13 0 %和 11 8%。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)合成长链二元酸途径的调节 Ⅰ.抑制和阻遏作用

尿素明显地影响热带假丝酵母的长链二元酸合成。当存在适量尿素(0.1％)时,长链二元酸大量合成,但当尿素量增加至0.2％以上时,长链二元酸基本上不积聚,但短链二元酸,主要是庚二酸有所增加。 尿素的利用呈S形曲线,说明尿素可能经酶的诱导利用。在发酵中当尿素量增至0.2％以上时,整个发酵过程均残留少量尿素,它对长链二元酸的合成起着调节作用。 发酵中加入和尿素含氮量相当的酒石酸铵或硫酸铵以代替尿素,或在适量尿素的发酵过程中,补加入和0.1％尿素含氮量相当的氨时,均不明显抑制长链二元酸的合成,但在不同时间补加入0.1％尿素时,则受强烈抑制。 适量尿素(0.1％)培养的休止菌体,在不同时间补加尿素都显著抑制长链二元酸的合成,表明尿素对已生成的酶系具有抑制作用。但过量尿素培养的休止菌体,不能转化烷烃生成长链二元酸,说明过量尿素所培养菌体的长链二元酸合成酶系受到显著的阻遏作用。 适量尿素培养的休止菌体,在不同时间加入氨,它的抑制作用远较尿素为低。用适量尿素含氮量相当的铵盐培养的休止菌体,亦具有类似现象,但过量氨培养的休止菌体转化时仍能生成多量长链二元酸。以上均说明尿素对长链二元酸合成的影响不是氨而是尿素分子本身起了抑制和阻遏作用。 尿素分子的化学结构类似物——硫脲和胍也具     

丙氨酸对热带假丝酵母NPcoN22长链二元酸发酵的调节

本文研究了丙氨酸对热带假丝酵母(Candida tropicalis)NPcoN22长链二元酸发酵的调节,并把它与尿素的调节作了比较。在蔗糖利用、烷烃利用、菌体生长、发酵液pH变化和十四烷一1,14一二羧酸积累诸方面以及在三羧酸循环、乙醛酸循环、过氧化氢酶等酶的活力方面,丙氨酸具有与尿素相同的调节作用。丙氨酸加尿素作为混合氮源或在正常发酵过程中补加尿素或丙氨酸,其调节效果与过量尿素或过量丙氨酸单独存在条件下的情况一样,说明尿素和丙氨酸的调节作用具有相加效应。发酵过程中菌体对丙氨酸的利用特点表明了丙氨酸是菌体生长的限制因子。Β一氧化的抑制剂——丙烯酸能显著提高十四烷一1,14-二羧酸的积累。     

长链二元酸发酵的特点及其控制

微生物发酵生产长链二元酸是以正烷烃为原料 ,它与历来以糖质为原料的发酵不同 ,有其自身的特点 :(1 )四相体系的发酵 :以糖质为原料进行微生物发酵时 ,只有菌体、空气和水三相体系 ,糖质原料易溶于水 ;而烃类发酵却是菌体、空气、烃类(油 )和水四相体系 ,石油烃类形成小油滴 ,微生物才能接触到烷烃 ,利用和氧化烷烃 ,产生二元酸。 (2 )需氧量和放热量大 :微生物发酵正烷烃生成二元酸时 ,增加了四个氧原子 ,因此需氧量大。有人经过试验和计算 ,认为烷烃发酵需氧量和放热量都是糖发酵时的 2～ 3倍。 (3)长链二元酸在水中溶解度小 :长链二元酸…     

酵母细胞转运正烷烃的研究——Ⅱ.糖类对突变菌株U_(3-21)的生长、乳化剂和二羧酸产生的影响

以不同碳链的正烷烃作为唯一生长碳源时,U_(3-21)菌株产生乳化剂的量不同,因而菌体生长也不同,产生乳化剂多的,菌体生长也好。本文主要报道在烷烃发酵中,糖类对菌株产生乳化剂的促进与抑制怍用,0.15%的蔗糖,大大促进了乳化剂的产生,加速菌体生长,提高二羧酸的产量。发酵培养基初始pH不同,也影响菌体生长和二羧酸产量。     

烷烃发酵产生1，13-十三碳二元酸及其诱导作用的研究

从能利用正十二烷产生1,12-十二碳二元酸的热带假丝酵母突变株D28出发,经两次紫外线照射诱变,选育到一株从正十三烷产生1,13-十三碳二元酸较高的突变株2—23号菌。该突变株较出发菌株提高产酸率20％,达40．4g／L。突变株2—23也能将一定链长的长链烷烃以较高的产率转变成相应的单一二元酸。此外,在产酸摇瓶条件试验中观察到烷烃的诱导作用,使突变株产酸能力得以提高。用烷烃预培养的种子发酵正十三烷,其产生1,13一十三碳二元酸的量较糖质碳源培养的种子发酵时要提高30％。     

烷烃发酵产生1，13-十三碳二元酸及其诱导作用的研究

从能利用正十二烷产生1,12-十二碳二元酸的热带假丝酵母突变株D28出发,经两次紫外线照射诱变,选育到一株从正十三烷产生1,13-十三碳二元酸较高的突变株2—23号菌。该突变株较出发菌株提高产酸率20％,达40．4g／L。突变株2—23也能将一定链长的长链烷烃以较高的产率转变成相应的单一二元酸。此外,在产酸摇瓶条件试验中观察到烷烃的诱导作用,使突变株产酸能力得以提高。用烷烃预培养的种子发酵正十三烷,其产生1,13一十三碳二元酸的量较糖质碳源培养的种子发酵时要提高30％。     

长链二元酸的来源

十个碳以上的长链二元酸,虽然是一类精细化工产品,有着重要和广泛的工业用途,但它们在自然界中不单独存在,其来源有３个途径：（１）植物油裂解制取：一部分长链二元酸,可以从植物油裂解制取。例如癸二酸（ＤＣ１０）是从蓖籽油裂解而得到。十三碳二元酸（ＤＣ１３）需从菜籽油中提取出甘油芥酸酯,然后再经臭氧氧化制取,但用此法制取的ＤＣ１３,其纯度只达到７０％左右,不符合化工上合成麝香－Ｔ香料的纯度要求;而十五碳二元酸（ＤＣ１５）,是从蒜头果油中提取出一种脑神经酸,再经过裂解才可得到。以上３种二元酸,虽可分别从３…     

长链二羧酸发酵的研究

经过筛选诱变,从热带假丝酵母(Candida tropicalis)1230得到一株能利用正烷烃产生较多长链二羧酸的突变株U3-21,该菌株能利用一系列单一正烷烃C10-C18 1产生与基质链长相应的二羧酸。摇瓶条件试验表明,静止细胞单一二羧酸的产量,除DC…及DC…”以外,为4.02—6.48％。用气液色谱鉴定,粗品二羧酸的纯度为92—98％。因而U3-21 是一株很有前途的优良生产菌株。     

高产十四碳二元酸的新菌株

中国科学院微生物研究所陈远童教授在石油微生物领域 ,微生物正烷烃代谢产物和代谢途径的基础理论研究以及微生物发酵正烷烃生产长链二元酸系列产品的应用开发研究中 ,取得优异成绩 ,尤其通过国家“八五”和“九五”科技攻关 ,先后培育出高产十五碳二元酸 (DC15)、十二碳二元酸 (DC12 )和十三碳二元酸 (DC13) 3株高产突变株 ,通过代谢调控和过程优化 ,在 2 5吨罐中试和 2 0吨罐规模工业生产试验研究中 ,把DC15、DC12 和DC13的发酵产酸水平稳定在 1 80～ 2 0 0g/L的国际领先水平。并率先在国内建成国际上首家千吨级规模的二元酸生产工…     

微生物的正烷烃代谢I．假丝酵母的正烷烃代谢产物的研究

我们研究了假丝酵母属不同菌种代谢正烷烃的产物,观察到其发酵液中均产生醇、酸、酯,由此可认为醇、酸、酯是烷烃代谢中正常而普遍的产物。由于菌种不同,代谢产物和途径亦不相同,如AS 2．1207菌能一端甲基氧化烷烃生成一羧酸,亦能两端甲基氧化生成二羧酸。而1230号菌及其突变株u㈦-则主要两端甲基氧化生成二羧酸。此外,As2．1 207悄能利用烷烃产生不饱和一羧酸及比基质链长的一羧酸,说明它姓一株具有脱氯驶加长碳链能力的黹株。     

N^＋离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母(Candidatropicalis)SCB412作为出发菌株,经能量50KeV、剂量l×1011～5×1015ions/cm2的N+离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变.N+离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系log(存活率%)=8.23-0.604×log(剂量),在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化.经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母SCB609.在初始正十二烷烃浓度为15%(v/v)下产酸量由43.5g/L上升到73.2g/L.比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化.     

十三碳二元酸的发酵条件初探

就假丝酵母对石油烷烃进行发酵生成十三碳二元酸进行了研究。当湿菌体含量升至 6 .0 %以上时 ,在pH7.0、温度 30℃和发酵时间 12 0h的条件下 ,流加轻油发酵 ,十三碳二元酸的生成量可达 70 g/L以上。     

诺卡氏菌对油酸的羟基化作用

诺卡氏菌(Nocardia sp．N13)休止细胞对油酸(顾-9-十八碳烯酸)进行羟基化作用。用休止细胞转化时最适温度为30℃,最适pH为6．5,当菌体(干菌)与底物的最适比例为20 ：1对,对油酸的转化率为83．4％,不同的表面活性剂影响转化的效果。N13休止细胞在磷酸缓冲液中重复转化3次仍可保持50％左右的转化率。红外光谱、质谱、棱磁共振鉴定产物为10－羟基硬脂酸。     

新兴的绿色化学工业──微生物发酵生产长链二元酸

微生物发酵生产长链二元酸是绿色化学生物合成中一个重要研究领域,它研究开发的成功和工业化生产,形成一个新兴的绿色化学工业。 长链二元酸（Ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ）,是指碳链中含有１０个以上碳原子的脂肪族二羧酸,包括饱和及不饱和二羧酸,它们是一系列精细化工产品,有着重要而广泛的用途,是化学工业中合成高级香料、高性能工程塑料、高档热熔胶、高温电介质、高级喷漆和涂料、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。这些长链二元酸,自然界中不单独存在,大多数饱和长链二元酸,在化学…     

十三碳二元酸发酵过程菌体生长期动力学模型及其应用

介绍了由十三碳烷烃生产十三碳二元酸的发酵过程,对其中的菌体生长期的代谢过程进行了分析。提出了以CO₂释放率判断菌体生长状况的方法,据此可确定进入产酸期的最佳时间．建立了菌体生长期底物消耗及菌体生长的动力学模型,对模型参数进行了回归估值。并对菌体生长期进行了拟合。结果表明,模型的计算值和实测值吻合得较好,平均相对偏差为2．4％。利用所建模型对菌体生长期进行多种操作条件下的模拟计算,结果表明,提高蔗糖浓度及初始菌体浓度均能显著地提高菌体生长期结束时的菌体浓度。     

绿色化学产业——微生物发酵生产长链二元酸

所谓长链二元酸是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸,它们是一类用途广泛和重要的精细化工产品,是化工上合成高级麝香香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电解质,高级尼龙粉末涂料和油漆、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、聚酐、医药和农药等的重要原材料。