沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3 的构建与鉴定

目的:构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法:首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果:酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论:成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

抗日本血吸虫pVAX1/ SjHGPRT·SDISP 多价疫苗的构建方法探讨

目的:探讨抗日本血吸虫生殖产卵编码基因多价疫苗pVAX1/SjHGPRT.SDISP的构建方法并从基因与蛋白水平验证该构建方法是否成功。方法:分别以pcDNA3.0/SjHGPRT、pcDNA3.0/SjSDISP为模板,设计引物扩增SjHGPRT、SjSDISP,采用overlap方法扩增全长SjHGPRT.SDISP。将纯化后的产物SjHGPRT.SDISP以及pVax1质粒采用Kpn I和Xba I双酶切,1%低熔点胶回收目的 DNA片段以及酶切后Pvax1载体片段双胶连。连接产物转化至DH5α细胞。挑选阳性克隆采用双酶切以及测序方法从基因水平鉴定是否构建成功。将构建产物免疫观察动物,采用免疫组化方法从蛋白水平鉴定疫苗pVAX1/SjHGPRT.SDISP是否构建成功。结果:酶切方法以及测序结果均显示重组质粒的插入序列分别与目的基因完全一致,昆明小鼠肌肉组织酶免疫组织化学染色显示免疫组小鼠肌细胞中呈现较强的棕黄色颗粒,而阴性对照组肌细胞呈阴性。结论:真核重组质粒pVAX1/SjHG-PRT.SDISP构建成功,且在昆明鼠肌肉细胞内能够获得良好的表达。     

基于同尾酶技术构建CCL3L1 基因串联重组质粒的方法

目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD18-T载体,阳性克隆命名为pMD18T-CCL3L1。BamHI和BglII双酶切pMD18T-CCL3L1和pcDNA6.2-GW/miR载体后将第一个CCL3L1片段插入pcDNA6.2-GW/miR载体命名为pcDNA6.2-CCL3L1-1。由于载体本身在BglII位点后带有XhoI酶切位点利用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收CCL3L1片段,BglII和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收大片段做载体重组形成含有两个连续CCL3L1片段的质粒命名为pcDNA6.2-CCL3L1-2,重复此步骤可得到含有N个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-X。结果:经酶切和测序证实成功构建含有4个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-4,并同时产生含有1个和2个CCL3L1基因串联体的重组质粒。结论:利用同尾酶技术可以快速有效地构建CCL3L1基因串联重组质粒,实现目的片段的无限扩大,为小片段基因表达的研究奠定基础。     

CDH17/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建肝肠钙黏连蛋白(CDH17)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究胃癌发病的分子机制和生物学行为以及寻找新的抗转移措施奠定理论基础。方法:用Trizol Reagent抽提胃腺癌组织中总RNA,采用逆转录巢式PCR方法扩增CDH17目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1(-),再将CDH17基因片断插入pcDNA3.1(-)线性质粒,即构建成CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒,将质粒转染感受态细胞DH5a,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论:CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒构建成功。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

中国春小麦puroindoline a基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:puroindoline(pin)基因在控制麦类作物的籽粒硬度中起着重要作用。构建真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp,为pina基因在哺乳细胞中的表达提供基础。方法:利用PCR方法从中国春小麦基因组中克隆到了pina基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )-gfp,用PCR和酶切鉴定重组子。结果:PCR和酶切鉴定表明,所构建的真核表达重组质粒为pcDNA3.1( )-pina-gfp;将该片段克隆到pCF-T载体中,经测序验证,表明其为目的基因。结论:构建的pina基因真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp为pina基因在哺乳动物细胞中的表达提供了基础。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3的构建与鉴定

目的：构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法：首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果：酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论：成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

小鼠EVL 基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建小鼠EVL(Ena/VASP like)基因的真核表达载体,为深入研究EVL的功能奠定基础.方法:采用PCR方法,从小鼠cDNA文库中,扩增出1245bp的EVL编码区片段,经电泳、胶回收后连接入pMD- 18T载体中,测序鉴定正确.用BamHI和HincⅡ双酶切,定向克隆EVL编码区片段到真核表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒正确后.将重组质粒转染入HELA细胞中,以RT-PCR检测EVL的mRNA的表达,以Western Blot检测EVL蛋白的表达.结果:酶切鉴定结果显示小鼠EVL编码区基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1中;RT-PCR和Western Blot结果以及免疫荧光染色显示Hela细胞中有EVL的mRNA和蛋白的表达.结论:成功获得pcDNA3.1 -EVL的真核表达载体,为进一步深入研究EVL蛋白的功能奠定了基础.