两种色型黄粉虫抗冻蛋白cDNA克隆、序列分析与表达分析

产生抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是大多数昆虫抵抗低温的一个重要策略。为给黄粉虫Tenebrio molitotr耐寒机理研究提供参考, 本研究采用RT-PCR、 5′ RACE和3′ RACE法克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的抗冻蛋白基因Tm-afp, 分析了其基因序列及所编码的氨基酸序列, 并检测了其在这两种色型间的mRNA水平差异。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫克隆出的Tm-afp cDNA全长分别为579 bp和588 bp, 它们包含一个20 bp的5′端非翻译区、 一个402 bp的开放阅读框和一个变异较大的3′ 端非翻译区, 其碱基序列一致性为95%。由于这两个抗冻蛋白基因编码的蛋白成熟肽存在两个氨基酸差异： 第35位（D→E）和130位（T→S）, 因此将其判定为黄粉虫抗冻蛋白基因Tm-afp的两个异构体, 并分别命名为Tm-afp-1和Tm-afp-2。Tm-afp-1和Tm-afp-2编码的抗冻蛋白异构体（分别为Tm-afp-1和Tm-afp-2 ）信号肽之间有3个氨基酸差异： 第2位（G→A）、 9位（S→T）和27位（Y→N）; 其成熟肽的第一个氨基酸为谷氨酰胺, 含8个高度保守的12 aa短串联重复序列, 每个重复序列的第2位和第8位为半胱氨酸。此外, Tm-afp-1和Tm-afp-2均属富含苏氨酸和半胱氨酸的昆虫抗冻蛋白, 其二级结构均由大量的β-折叠和无规则卷曲组成, 三级结构为8个特殊的右手β-螺旋, 每一圈螺旋由12个氨基酸组成; 在β-螺旋的一个侧面规则排列着由保守XCT形成的β折叠片层。同时, 低温可以诱导黄、 黑两种色型黄粉虫Tm-afp的表达, 但长时间低温诱导下黑色型黄粉虫幼虫的Tm-afp表达量显著高于黄色型黄粉虫幼虫Tm-afp表达量。结果提示, 黄粉虫种内不同色型间, 抗冻蛋白基因Tm-afp可能存在多种异构体, 并且黑色型黄粉虫Tm-afp比黄色型黄粉虫Tm-afp对低温的应答更强烈。这一研究结果为进一步探索黄粉虫的耐寒性机理提供了有益参考。     

两种色型黄粉虫的生长发育、存活与饲料利用效率比较研究（英文）

黄粉虫Tenebrio molitor L.是一种重要的资源昆虫, 根据60日龄幼虫的体壁颜色, 通过连续12代的自然选育, 获得了黄、 黑2种色型黄粉虫。为进一步给黄粉虫优良品种培育提供科学的理论依据, 本实验首先对选育出的2种色型黄粉虫的生长发育、 存活及饲料利用效率进行了比较研究。结果表明： 2种色型黄粉虫的孵化率和化蛹率均约为83%和97%, 无显著差异; 但黄色型成虫的羽化率（♀：95%, ♂：91%）却明显高于黑色型成虫的羽化率（♀： 82%, ♂： 83%）。2种色型黄粉虫的卵和蛹历期均约为7 d和10 d, 亦无显著差异; 但黑色型幼虫较黄色型幼虫发育更快、 更整齐。黑色型幼虫共历经12~15龄, 黄色型幼虫历经12~17龄, 并且2种色型黄粉虫幼虫均以历经14龄居多, 历经14龄的黄、 黑2色型黄粉虫幼虫的比例分别为27%和53%。以14龄计, 黄、 黑2色型黄粉虫从卵至成虫的总历期分别为171 d和151 d。此外, 黄色型幼虫对饲料的平均利用效率明显高于同日龄黑色型幼虫, 黄色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为66.5%, 50.6%和33.6%, 而黑色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为62.1%, 46.8%和29.1%; 但2种色型黄粉虫同日龄幼虫的生长率和存活率差异不显著。综合上述结果可知, 黑色型黄粉虫较黄色型黄粉虫发育更快、 更整齐, 而黄色型黄粉虫对饲料的平均利用效率明显高于黑色型黄粉虫。这为进一步培育黄粉虫优良品种提供了有益参考。     

黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达（英文）

为给黄粉虫Tenebrio molitor抗逆机理研究提供理论依据, 本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70, 并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明： 克隆出的Tmhsp70 序列全长2 282 bp, 具有一个富含A的115 bp 5′ 非翻译区和一个1 935 bp的开放阅读框及一个富含A、 T的232 bp 3′-非翻译区。5′-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn, 3′-非翻译区末端有长22 bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白（TmHSP70）具有3个典型的HSP70特征基序（IDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ）和1个胞质HSP70末端特征基序（EEVD）, 无信号肽和跨膜区域, 包含2个主要的结构域, 即： N-端42 kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18 kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成, 具有1个核苷酸结合中心; 多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋, 内含1个多肽结合通道。此外, 黄粉虫Tmhsp70 mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明, 42℃热激1 h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70 mRNA的表达量上升了1.4~26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70 mRNA 表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量; 42℃热激1 h 后90日龄幼虫中的Tmhsp70 mRNA 表达量最丰富, 既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量, 也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、 功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。     

中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana dynactin p62基因的表达特性, 本研究克隆了中华蜜蜂dynactin p62的基因组DNA序列(GenBank登录号： JX101463) 和mRNA序列（GenBank登录号： JX101464）; 采用荧光定量PCR检测了中华蜜蜂dynactin p62在不同发育时期（3日龄和6日龄幼虫、 刚羽化出房蜜蜂）三型蜂中mRNA的表达量。结果表明： 该基因基因组DNA序列全长为2 403 bp, mRNA序列全长为1 491 bp, 编码496个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为56.49 kD, 等电点为8.31。系统发育分析表明中华蜜蜂dynactin p62与西方蜜蜂Apis mellifera dynactin p62聚成一支。该基因在不同发育时期均有表达, 在雌性蜜蜂（蜂王和工蜂）中, 刚羽化成虫期的表达量显著高于幼虫期(P<0.05), 并且同一发育时期相比, 工蜂的表达量显著高于蜂王(P<0.05); 而该基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这些结果提示该基因可能与中华蜜蜂级型分化有关。     

野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA的分子克隆及其特征

酚氧化酶在昆虫的免疫防御机制中起着重要作用。利用RT-PCR和RACE方法,克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因,获得了其cDNA序列。该序列长2 134 bp,含有一个2 082 bp的完整开放阅读框,编码一个由693个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。组织特异性表达分析表明了该基因在野桑蚕5龄幼虫的血细胞、体壁、头部、精巢、卵巢、脂肪体和中肠等组织及其不同的发育阶段均有表达。这些结果为进一步研究野桑蚕酚氧化酶原基因的功能提供了分子基础。     

温度对黄粉虫幼虫生长发育及体液免疫防御能力的影响

【目的】探究饲养温度对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫生长发育和体液免疫防御的影响。【方法】测定了不同温度（18, 22, 26和30℃）下饲养的黄粉虫幼虫的发育历期、蛹重、化蛹率;采用抑制区分析法测定了不同温度下饲养的免疫（用生理盐水将大肠杆菌Escherichia coli配制成1×104个菌体/μL悬浮液,用微量注射器将其注入虫体腹部的背面,每头幼虫注射1 μL）和非免疫(注射生理盐水)黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌和溶菌酶活性,通过分光光度法测定了其酚氧化酶活性。【结果】结果显示,黄粉虫幼虫发育历期随饲养温度的上升而明显缩短（P<0.0001）,而不同温度下蛹重（P=0.067）与化蛹率（P=0.869）差异不显著。免疫组黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌、酚氧化酶和溶菌酶活性随饲养温度上升而降低：抑菌和酚氧化酶活性随温度变化差异极显著（P<0.0001）,溶菌酶活性差异显著（P=0.013）。【结论】本研究结果表明,温度对黄粉虫的生长发育和免疫防御具有较大的影响,低温下黄粉虫幼虫的发育历期延长,但其体液免疫防御能力明显增强。     

红螯螯虾酚氧化酶原及其特性研究

采用同源克隆策略和RACE技术, 从红螯螯虾Cherax quadricarinatus血细胞中克隆得到酚氧化酶原基因的全长cDNA序列, 共2951 bp, 开放读码框为1995 bp, 编码665个氨基酸. 预测的分子量和等电点分别为75.7 kD和6.23. 酚氧化酶原含有两个推测的tyrosinase copper-binding motifs (带有六个组氨酸残基)和一个thiol-ester-like motif, 这些特征和其他甲壳动物的酚氧化酶原特征相同. 红螯螯虾酚氧化酶原氨基酸序列与通讯螯虾Pacifastacus leniusculus、欧洲龙虾Homarus gammarus、美洲龙虾Homarus americanus 和克氏原螯虾Procambarus clarkii 酚氧化酶原的相似率分别为68%、63%、63%和59%. 酚氧化酶原基因双酶切后连接入pET-28a原核表达载体, 转化到大肠杆菌BL21后重组表达酚氧化酶原蛋白. 在重组蛋白纯化后, 免疫新西兰大耳兔制备得到的酚氧化酶原多克隆抗体, 其效价大于1:12800. 红螯螯虾血淋巴、肝和鳃组织中的酚氧化酶原mRNA表达和酚氧化酶活性较高, 而神经、心、肠和肌肉中较低. 中华绒螯蟹螺原体和嗜水气单胞菌免疫红螯螯虾后, 血淋巴细胞、肝和鳃组织中的酚氧化酶原和酚氧化酶活性在免疫后的不同时间均出现了显著性的增加, 此结果表明酚氧化酶原和酚氧化酶在红螯螯虾对抗细菌感染的过程中起到重要的免疫作用. 此结果为进一步深入研究酚氧化酶原基因和酚氧化酶的功能及其调控机理奠定基础.       

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

丽蝇蛹集金小蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂基因nvpp-1和nvpp-2的功能研究

Pacifastin蛋白酶抑制剂在昆虫免疫与发育中起着重要作用。为了明确其在寄生蜂中的相关功能, 本研究分别克隆获得编码丽蝇蛹集金小蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂开放阅读框的cDNA序列nvpp-1和nvpp-2, 序列长度分别为723和888 bp, 分别编码240和295个氨基酸残基。预测结果表明, nvpp-1和nvpp-2推导氨基酸序列N端均含一个长度为17个氨基酸残基的信号肽序列。序列分析和进化树构建结果表明, NVPP-1和NVPP-2分别含有5个和4个典型的Pacifastin保守结构域, 并与疑黑瘤姬蜂Pimpla hypochondriaca毒液蛋白CVP4 聚为一类。实时荧光定量RT-PCR结果表明, nvpp-1和nvpp-2于该蜂雌蜂各组织中均发生转录, 且在胸、 腹部残体（解剖后腹部剩余部分）和毒器官中的转录水平较高; 于毒器官中, 其在羽化初期（0和1 d）转录水平较高, 其转录水平显著降低。Western blot结果表明, NVPP-1和NVPP-2均只在毒液中被大量检出, 在其他待测组织中均未被检出, 而刚羽化时（0 d）其在毒液中含量较低。利用pET-28a (+) 载体分别对nvpp-1和nvpp-2进行了原核表达, 并对重组表达产物进行纯化。分别测定重组NVPP-1和NVPP-2对4种不同丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、 糜蛋白酶、 蛋白酶K和弹性蛋白酶）的抑制效果, 结果表明, 重组NVPP-1和NVPP-2分别能显著抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶活性。同时还分别测定了两种重组蛋白对寄主家蝇蛹血淋巴自身的酚氧化酶活性及原酚氧化酶激活反应的影响, 结果表明, 重组蛋白对家蝇蛹血淋巴原酚氧化酶激活反应亦有抑制效果, 但其均不能显著影响血淋巴自身的酚氧化酶活性。综上所述, 丽蝇蛹集金小蜂毒液中含有Pacifastin蛋白酶抑制剂NVPP-1和NVPP-2, 分别为糜蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂家族成员, 均能显著影响寄主家蝇蛹血淋巴原酚氧化酶激活反应, 从而削弱寄主体液免疫水平。本研究所获结果加深了我们对昆虫尤其是寄生蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂作用的认识。     

棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列。该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76％～80％),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征。组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达。     

A novel calcium-binding peptide from the cuticle of the crayfish, Procambarus clarkii

A novel peptide named calcification-associated peptide (CAP)-2 was isolated from the exoskeleton of the crayfish, Procambarus clarkii. CAP-2 consists of 65 amino acid residues and has a 44% sequence identity with CAP-1 characterized previously. It has a chitin-binding domain observed in many arthropod cuticle proteins. CAP-2 showed inhibitory activity on calcium carbonate precipitation and chitin-binding ability. A CAP-2 cDNA was cloned using RT-PCR and RACE and the open reading frame encoded a precursor peptide consisting of a signal peptide and CAP-2. RT-PCR revealed that CAP-2 mRNA was exclusively expressed in the epidermal tissue during the postmolt stage, the site and stage being associated with calcification. Calcium-binding assay using recombinant CAP-2 revealed that this peptide had affinity for calcium ions with a Kd value of about 1 mM. All these results suggest that CAP-2 serves as a nucleator or a regulator in the calcification of the exoskeleton.     

Prophenoloxidase-activating proteinase-2 from hemolymph of Manduca sexta. A bacteria-inducible serine proteinase containing two clip domains

Proteolytic activation of prophenoloxidase in insects is a component of the host defense system against invading pathogens and parasites. We have purified from hemolymph of the tobacco hornworm, Manduca sexta, a new serine proteinase that cleaves prophenoloxidase. This enzyme, designated prophenoloxidase-activating proteinase-2 (PAP-2), differs from another PAP, previously isolated from integuments of the same insect (PAP-1). PAP-2 contains two clip domains at its amino terminus and a catalytic domain at its carboxyl terminus, whereas PAP-1 has only one clip domain. Purified PAP-2 cleaved prophenoloxidase at Arg(51) but yielded a product that has little phenoloxidase activity. However, in the presence of two serine proteinase homologs, active phenoloxidase was generated at a much higher level, and it formed covalently linked, high molecular weight oligomers. The serine proteinase homologs associate with a bacteria-binding lectin in M. sexta hemolymph, indicating that they may be important for ensuring that the activation of prophenoloxidase occurs only in the vicinity of invading microorganisms. PAP-2 mRNA was not detected in naive larval fat body or hemocytes, but it became abundant in these tissues after the insects were injected with bacteria.