Protoplasten aus Basidien und vegetativen Zellen von Coprinus radiatus

Aus dem dikaryotischen Mycel und dem Hymenium dreier verschiedener Entwicklungsstadien der Fruchtkörper von C. radiatus sind Protoplasten hergestellt worden. Dabei zeigte sich, daß auch aus differenzierten pilzlichen Zellen Protoplasten isoliert werden können. Zum enzymatischen Abbau der Zellwände wurden das chitinolytisch aktive Autolysat dieses Pilzes sowie im Handel erhältliche Enzyme verwendet. Die Protoplastenbildung setzt nach einer Inkubationszeit von 15 bis 30 Minuten in der Enzympräparation ein und ist nach 2 bis 4 Stunden abgeschlossen. Es wird nachgewiesen, daß Basidien die einzigen Zellen des bereits differenzierten Hymeniums sind, aus denen Protoplasten isoliert werden können. Die Protoplastenbildung erfolgt an Perforationen im Apikalbereich der Basidien, vermutlich den Loci der später einsetzenden Sterigmenbildung. Die Ausbeute an Basidialprotoplasten beträgt durchschnittlich 8,4 times 10⁵ je g Fruchtkörperfrischgewicht.     

Erzeugung eines zellwandlytischen Enzymkomplexes aus Arthrobacter GJM-I zur Herstellung von Protoplasten aus Candia spec. H

Growing conditions have been found out for the bacterium Arthrobacter GJM-I to produce a lytic enzyme system, which converts cells of the yeast Candida spec. H to protoplasts quickly and in a good yield. Estimating the activities of α-mannanase and β-glucanase we found out the optimal culture time to gain the lytic enzyme system from the culture filtrate. It was shown that radioactive labeling of the yeast cells makes it possible to estimate quantitatively the conversion to protoplasts and the simultaneous lysis. The obtained lytic enzyme system can substitute the snail cnzyme system which was used for cell conversion of Candida spec. H to protoplasts till now.     

Protoplasten der Hefe Rhodotorula gracilis

Zusammenfassung Die Protoplasten der obligat aeroben Hefe Rhodotorula gracilis wurden hinsichtlich ihrer charakteristischen physiologischen und Transporteigenschaften mit intakten Zellen verglichen. Folgende Ergebnisse wurden gewonnen: 1. Endogene und durch d-Glucose stimulierte Atmung entsprach den Werten von intakten Hefezellen. 2. d-Glucose wurde von Protoplasten aus dem Medium aufgenommen und abgebaut. 3. Die Aufnahme von d-Xylose führte zu vielfacher Akkumulation der Pentose im Zellinnern. Nach 50 min wurde ein für den Xyloseabbau induziertes System wirksam. 4. Bei Zugabe im Gemisch wurde die Aufnahme von d-Xylose durch d-Glucose unterbunden. 5. Akkumulierte d-Xylose wurde bei Zugabe von d-Glucose im Austauschtransport durch den mobilen Träger aus der Zelle heraus befördert. 6. Der Zuckertransport, gemessen an der d-Xyloseaufnahme, war streng stoffwechselenergieabhängig und wurde durch Entkoppler vollständig gehemmt.Diese Ergebnisse zeigen, daß die Stoffwechsel- und Transportfunktionen der intakten Hefezellen in ihren Protoplasten vollstädig erhalten bleiben. Die Anwendung von R. gracilis-Protoplasten zur Klärung spezieller Fragestellungen ergab: 1. Der Transport von d-Trehalose erfolgte nach extracellulärer Spaltung des Disaccharides durch Aufnahme der entstandenen Glucose. 2. Densitometrische Messungen an Protoplastensuspensionen zeigten sich geeignet zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Zuckeraufnahmevorgängen.

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Protoplasts from the yeast Rhodotorula gracilis II. Physiological and transport properties

The protoplasts of the obligatory aerobic yeast Rhodotorula gracilis (5/Fres/Harrison) were compared with the intact yeast cells with respect to the identity of their physiological and transport properties. It was found: 1. The rates of endogenous and glucose-stimulated respiration of protoplasts were similar to those of the whole cells. 2. d-glucose was taken up from the medium with constant velocity; no free glucose could be detected inside the protoplasts. 3. The uptake of d-xylose led to manifold accumulation of the pentose intracellularly. Within 50 min incubation an enzyme system for the degradation of d-xylose became effective. 4. In a mixture of d-xylose and d-glucose the latter blocked the uptake of the pentose. 5. d-xylose once accumulated was exchanged by the mobile membrane carrier for d-glucose after its addition to the protoplast suspension. 6. Addition of NaN₃ or CCCP resulted in an inhibition of d-xylose uptake. The transport process is tightly coupled to cell metabolism.It is concluded that the metabolic and transport functions of R. gracilis protoplasts equal those of the intact yeast cells. The application of the protoplasts to study some special transport problems revealed: 1. In the course of d-trehalose uptake the disaccharide was cleaved to glucose, which was actually transported across the cell membrane. 2. Densitometry of protoplasts suspensions was found suitable for the continuous recording of sugar uptake processes. This observation is of special importance for further investigations of the oscillations in sugar transport observed earlier (Heller and Höfer, 1973).

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Herrn Professor Dr. Maximilian Steiner zum 70. Geburtstag gewidmet.     

Manometrische Atmungsmessungen an Protoplasten vonPetunia

Respiration of protoplasts isolated from the leaf mesophyll ofPetunia hybrida was estimated by the Warburg method. The time course of respiration rate shows an initial decrease followed by a prominent increase which is caused by shaking of the protoplast suspension. The absolute respiration rates are low and show an unusual spread, but the temporal form of the curve is always similar to that one shown in Fig. 1. The RQ-values shift from below 1 during the initial phase to far above 1 during the increase of the respiration. For isolated protoplasts from petals the same is true. Feeding the protoplasts with DNA does not influence the respiration rate significantly. The physiological quality of protoplasts seems to suffer in a high degree from the isolation process.     

Die Differenzierung des Protoplasten der DiatomeeSynedra

Zusammenfassung Synedra ulna undS. capitata besitzen eine ganz bestimmte, zum Teil mit der beträchtlichen Längenausdehnung im Zusammenhang stehende Gliederung des Protoplasten: peripher festes Plasma, das außer den Chromatophoren das Plattenband umfaßt, eine eigenartige longitudinale Struktur, die gewissermaßen die plasmatische Scheidewand bei der kommenden Teilung antizipiert; an die Vakuole grenzend strömendes Plasma, das regelmäßig die merkwürdigen, noch leichter als die Chondriosomen zerstörbaren, aber eigenwillig geformten Halbhantel-körper enthält.Die Chondriosomen liegen im unbewegten Plasma, gelangen aber mitunter in das bewegte Plasma. Die oft beschriebenen Spirochaetenbewegungen kommen wohl, im Verein mit hoher Flexilität, durch teilweise Verankerung im festen Plasma zustande.Die Halbhantelkörper erfahren an den subapikal auf den Schalen gelegenen Röhrenporen eine lokale Häufung, die auf dem Übertritt des einen Endes, und zwar immer des verjüngten, an dieser Stelle in das unbewegte Plasma beruht.Die Plättchen des Plattenbandes sind den um den Kern kalottenförmig angeordneten Plättchen anderer Diatomeen und den Doppelplatten vonPinnularia u. a. sehr ähnlich; vielleicht sind alle diese Bildungen identisch und treten bei verschiedenen Arten vikariierend in verschiedener Anordnung auf.Die Gallertausscheidung, die zur Bildung der Basalen führt, erfolgt offenbar nicht durch die Röhrenporen, sondern entlang einer am Schalenmantel lokalisierten Zone. Die Röhrenporen scheiden vielleicht die Bewegungsgallerte aus. Außerdem ist die ganze Zelle diffus von einer dünnen Gallerthaut eingehüllt.Plasmolyseversuche ergeben negative Plasmolyseorte an der eng umschriebenen Stelle, wo der Protoplast an die übergreifende Schale grenzt. — Das gleiche gilt fürNitzschia sigmoidea.Die bedeutende Länge derSynedra-Zelle ermöglicht es, das eine Ende zu schädigen oder zum Absterben zu bringen, während das andere noch relativ lange weiterlebt.     

Messung nichtosmotoscher Wasseraufnahme an plasmolysierten Protoplasten

Ohne ZusammenfassungMit 3 Textabbildungen.     

Regeneration fragmentierter,nackter Protoplasten in Hefezellen

Summary The organism used wasSaccharomyces ellipsoideus. Exposure of yeast cells to a hypertonic strontium chloride generally does not establish typical plasmolysed cells. Rather, during a short period of exposure to plain hypertonic strontium chloride solution or to a hypertonic medium supplemented with high content of strontium chloride, the cell walls ruptured and subsequently the formation of spherical osmotically fragile bodies observed. Being associated with large droplet of protoplast together with the plasmolysed cells in the medium, abundantly small and numerous particles imperfectly for reliable counts to be made appear.About other kinds of salts, the protoplast of the yeast cell used separated from the wall smoothly when plasmolysed with sodium chloride or potassium chloride. But calcium chloride increasingly produced the cell rupture. However subsequent successive growth of small particles of protoplast could not be observed in the medium containing calcium chloride. Despite similar results using manganese chloride or magnesium chloride, it seems to cause the damage of the sub cellular structure during prolonged incubation. Similar result was obtained, when the cells were treated in polyethyleneglycol solution.After incubation into liquid strontium medium containing 2 mol strontium chloride, subcellular particles were isolated by the peculiar method (Fig. 6) and were incubated further. Such particles multiplicated, they being designated as K-fragment, and enlarged in size, and became K-body. The size of K-body was threefold as large as that of K-fragment. After further prolonged incubation K-body also enlarged in size, calling it K-cell. The protoplasm of K-cell was less well organized, but the early stage of the formation of daughter K-cell as revealed by microscopical observation beared resemblance to the budding found in mother yeast cell.The findings considered in conjunction with our cytochemical studies of the action of solutions of RNase or DNase, or the stain with some basic dyes, have led us to the conclusion that macromolecular fragment and nuclear substance present in the K-fragment, K-body and K-cell, respectively. Regeneration will result in the most miniature feature of the yeas cell.

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Herrn Prof. Dr. Karl Höfler zu seinem 70. Geburtstag in Verehrung gewidmet.     

Osmotisch bedingte polare Verlagerungen im Protoplasten vonCladophora prolifera

Ohne ZusammenfassungFür die gastliche Aufnahme in Neapel sei dem Direktor der Stazione Zoologica Herrn Dr. Peter Dohrn auch an dieser Stelle herzlicher Dank gesagt.     

Versuche zur Bestimmung des spezifischen Gewichts nackter Protoplasten

Zusammenfassung Für Bestimmungen des spezifischen Gewichtes nackter oder experimentell entblößter Protoplasten eignet sich vor allem die Schwebemethode, zu welcher mehrere Abwandlungen unter Benutzung des Durchflußobjektträgers als Schwebekammer erprobt worden sind. Außer einer Art Indikatoren-Verfahren, das in den beiden angeführten Modi schon gute Durchschnittswerte liefert, ist unter geringen Abänderungen auch die in der Physik übliche Arbeitsweise empirischen Mischens anwendbar, die zu Werten höchster Genauigkeit führt.Schließlich werden einige Ergebnisse diskutiert und neue Aufgaben umrissen.     

Versuche zur Emission elektrischer Wellen durch lebende Protoplasten

Zusammenfassung Gleich lebenden Organismen eignen sich auch verschiedene Protoplasten während ihres Vitalzustandes zur Emission und in etwas abgeschwächtem Grade zur Absorption elektro-magnetischer Wellen. Die Objekte sind also offenen Oszillatoren zu vergleichen, die mit Selbstinduktanz und Kapazität ausgestattet sind. Die praktische Bedeutung des Phänomens für die Protoplasmatik als Indikator vitalen Verhaltens leuchtet ein, seine wissenschaftliche Bedeutung für die Annahme einer (fibrillaren) Strukturierung des Protoplasmas ist noch unsicher.     

Versuche über neue mikro-refraktometrische Methoden an Protoplasten. I

Zusammenfassung Das geeignete Messungsprinzip für mikro-refraktometrische Bestimmungen an Protoplasten und beliebigen Flüssigkeiten wird in der Ausmessung der Entfernung der Hyperbelpole mit monochromatischem Licht durchleuchteter zweiachsiger Kristalle gefunden. Indem jene Distanz ein geeignetes Maß für den scheinbaren (äußeren) Achsenwinkel solcher Kristalle abgibt und dieser in bekannter Weise von ihrem Refraktionsvermögen n determiniert wird, ist eine Berechnung der Brechungskoeffizienten in solchem Falle möglich, daß die Kristallplatten vertikal zur ersten Mittellinie des Winkels ihrer optischen Achsen geschnitten worden sind.Die Methode ist an einigen Modellflüssigkeiten erprobt und ausreichend genau gefunden worden. Bei ihrer Anwendung auf verschiedene Objekte der Protoplasmatik resultieren einleuchtende oder mit früheren Messungen bis auf mehrere Dezimalstellen übereinstimmende Werte der Brechungskoeffizienten.     

Zellwandregeneration und Peroxidase-Isoenzym-Synthese isolierter Protoplasten von Nicotiana tabacum L.

Summary Mesophyll-protoplasts of tobacco show increasing peroxidase-activity immediately after isolation. This is due to an enhancement of activity of the constitutive isoenzymes of G_III (=slow migrating cathodic group) and to a new formation of G_II-isoenzymes (=slow migrating anodic group). (G_II is not present in intact leaves.) As both processes are inhibited by actinomycin and actidion it is assumed that there is a new synthesis of peroxidase enzymes —The peroxidase reaction is independent of the further development of the protoplasts, as was evidenced by culturing protoplasts in different media which regulate the development of the protoplasts. Peroxidase reaction is always the same whether or not there is cell-wall synthesis and cell division. This leads to the conclusion that peroxidases in this case have no relation to synthesis of primary cell-walls. On the other hand they could be related to the dedifferentiation processes that always take place in isolated protoplasts.In the protoplasts G_II is localized in the cytoplasma as G_III is, because G_II appears before cell walls are synthesised and there is no lack of G_II isoenzymes when protoplasts are remazerated after having formed new cell walls.G_I (fast migrating anodic group), which is not detectable in isolated protoplasts, appears again after small calluses have developed out of protoplasts. Therefore as far as function is concerned G_I is quite different from G_II and G_III. The results confirm the hypothesis that G_I is localized in intercellular spaces only. It is discussed whether all of the isoenzymes of peroxidase detectable in crude extracts are cytoplasmic ones.     

Mitochondrial DNA diversity and male sterility in natural populations of Daucus carota ssp carota

Mitochondrial variability was investigated in natural populations of wild carrot (Daucus carota ssp carota) in different regions: South of France, Greece, and various sites in the Mediterranean Basin and Asia. Total DNA was digested with two restriction endonucleases (EcoRV and HindIII) and probed with three mitochondrial DMA-specific genes (coxI, atp6, and coxII). Twenty-five different mitochondrial types were found in 80 analyzed individuals. Thirteen mitotypes were found among the 7 French populations studied. On average, 4.4 different mitotypes were observed per population, and these mitotypes were well-distributed among the populations. All of the mitochondrial types were specific to a single region. However, the proportion of shared restriction fragments between 2 mitotypes from different regions was not particularly lower than that which occurred among mitotypes from a single region. On the basis of the sexual phenotype [male-sterile (MS) or hermaphrodite] of the plants studied in situ and that of their progeny, 2 mitotypes were found to be highly associated with male sterility. Eighty percent of the plants bearing these mitotypes were MS in situ, and all of these plants produced more than 30% MS plants in their progeny. This association with male sterility was consistent in several populations, suggesting an association with a cytoplasmic male-sterility system. Moreover, these two mitotypes had very similar mitochondrial DNA restriction patterns and were well-differentiated from the other mitotypes observed in wild plants and also from those observed in the two CMS types already known in the cultivated carrot. This suggests that they correspond to a third cytoplasmic sterility.