人源μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的cAMP上调作用研究

μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RT-PCR法扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA3．1( )中,转染CHO细胞后筛选单克隆细胞株,检测重组细胞株表达的μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的胞内信号转导能力。通过激动剂慢性作用信号转导分析证实,DAMGO能够明显抑制吗啡慢性给药引起的重组细胞株胞内cAMP水平的上调作用,初步揭示了阿片受体与特异性配体相互作用的信号转导机制。     

人源μ型阿片受体的cDNA克隆及转染CHO细胞的活性分析

μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RTPCR扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA31(+)中,用酶切鉴定正确的重组质粒转染CHO细胞。筛选的单克隆细胞株,检测阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体介导胞内信号转导的能力。通过与激动剂和拮抗剂的信号转导分析证实,阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体与天然的μ型阿片受体具有基本一致的生物学特性,因此可以用来作为高效镇痛低成瘾药物筛选平台的候选细胞株。     

全长及缺失VLDL受体基因转染的CHO细胞与β-VLDL的结合效应

为探讨 VLDL受体结合域中 8个重复序列在结合 VLDL中所起的作用 ,利用构建的全长VLDL受体 c DNA和缺失 5个重复序列的该受体 c DNA重组表达载体分别导入 CHO细胞中 .RT- PCR可检测到外源性 VLDL受体基因的表达 .受体与配体结合研究表明 ,转染全长 VLDLR重组体的 CHO细胞结合β- VLDL的能力明显高于转染 VLDLR缺失重组体的 CHO细胞 ,表明人VLDL受体在 CHO细胞中能有效表达 ,而缺失 5个重复序列的 VLDL受体基本失去了结合β-VLDL的能力     

细胞核受体LXRβ的体外酶标测活方法的建立与应用

目的:克隆并表达大鼠细胞核受体LXRβ配体结合区(LBD)序列,并进行配体依赖性受体与共激活因子结合区短肽相互作用的酶标法分析,建立简易经济可靠的体外高通量筛选LXR调节剂方法.方法:从含大鼠LXRβ cDNA序列的pSG5/rLXRβ上扩增LBD区序列,测序核实序列后,将此序列克隆入表达载体,构建原核表达载体pET28a(+)-rLXRβ-LBD;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting检测及Ni2+亲和层析柱分离纯化;建立ELISA方法检测配体依赖性受体-共激活短肽相互作用.结果:重组蛋白rLXRβ-LBD在大肠杆菌中高效表达(占菌体总蛋白30%),SDS-PAGE显示在36kDa处有免疫特异性蛋白,纯化后全长蛋白占90%以上.ELISA结合测试显示在激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺存在时,rLXRβ-LBD能与共激活短肽结合,亲和力与双荧光酶报告基因测活结果吻合.结论:成功克隆并表达rLXRβ-LBD序列,建立起ELISA筛选方法,为LXR-LBD配体功能活性的研究和配体的高通量筛选提供新方法.     

用a1D受体高表达细胞膜色谱研究9种配体的生物亲和作用

为了增加细胞膜色谱法的选择性和特异性,用受体高表达细胞膜色谱法研究9种a1-肾上腺素受体配体与a1D-肾上腺素受体亚型(a1D-AR)的生物亲和作用.培养稳定表达a1D-AR的HEK293细胞株,制备细胞膜固定相,应用受体高表达细胞膜色谱法研究不同配体与a1D-AR的结合情况.结果表明:9种不同的a1-肾上腺素受体配体与大鼠a1D-AR的亲和顺序为:哌唑嗪,BMY7378,酚妥拉明,羟甲唑啉,5-甲基乌拉地尔,去甲肾上腺素,苯肾上腺素,甲氧明,RS-17053.受体高表达细胞膜色谱法是一种特异、可靠的生物亲和色谱方法,可用于a1D-AR亚型选择性药物的高效筛选.     

“内吗啡肽”的发现是阿片肽研究的一次突破

早在７０年代,人们即发现了内源性的δ阿片受体选择性配体（脑啡肽）和ｋ阿片受体选择性配体（强啡肽）,但一直未能找到内源性的μ阿片受体的选择性配体。１９９７年４月英国出版的“自然”杂志报道,发现了两种内源性的α阿片受体选择性配体,分别命名为ｅｎｄｏｍｏｒｐｈｉｎ－１（ＥＭ－１）和ｅｎｄｏｍｏｒｐｈｉｎ－２（ＥＭ－２）可译为“内吗啡肽”。本文拟就内吗啡肽的发现过程及其与其它内阿片肽的关系作一简要介绍。     

孤啡肽在大鼠脑内对抗吗啡镇痛

脑内全新的阿片受体样受体（１９９４）及其内源性配体孤啡肽（１９９５）的发现形成了中枢神经系统阿片／抗阿片相互关系的研究领域中一个新的推动力。基于它们与阿片家族的高同源性及在脑内痛觉整合相关区域的丰富表达,本实验观察了ＯＦＱ在大鼠脑内对吗啡镇痛作用的影响。结果表明：（１）ＯＦＱ可以对抗脑室注射生理盐水引起的镇痛,后者可能是一种由内源性阿片系统介导的应激镇痛。（２）脑室注射ＯＦＱ在很大的剂量范围（４０     

血浆中的可溶性受体

可溶性受体的来源大致分为膜受体的胞外段经水解酶水解释放、基因选择性拼接、病毒基因的表达、人工基因重组。可溶性受体的作用机制包括作为相应膜受体的竞争者阻断配体的信号转导,作为血清结合蛋白转运、稳定、富集配体,下调膜受体数量,上调配体效应等。其临床应用主要是作为某些疾病的监测指标和相应细胞因子的拮抗剂。     

阿片受体研究最新进展──看分子药理学研究动向

阿片受体研究自1992年δ受体克隆成功;发展迅速,1993年μ、κ受体也克隆成功。1994年发现阿片孤儿受体ORL－1,1995年即找到ORL－1的内源性配体Nociceptin（OrphaninFQ）。1996年成功地应用基因敲出技术制成缺乏μ受体基因的小鼠,证明吗啡镇痛及成痛形成通过μ受体。1997年又发现了μ受体内源性配体endomorphine－1和endomorphine－2。我国学者研究成功的羟甲芬太尼的八个立体异构体合成,发现F－9202和F－9204是当前μ受体选择性最高的配体。计算机模拟μ受体三维结构及定点突变工作证明Tyr－148及His－319是羟甲芬太尼的结合位点。这些进展反映了当前神经分子药理研究的动向。     

Eph受体家族及其配体的信号转导途径及功能

Eph受体是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族,Eph受体和其膜附着型配体（ephrin）在发育过程中呈现不同的表达模式,近来研究证明,Eph受体和其配体在包括神经网络形成,神经管和轴旁中胚层的成型（patterning）,细胞迁移导向和轴突路径导引,血管形成等许多的发育过程中起重要作用.Eph受体及其配体也与肿瘤发生有关,因此深入分析这些分子尤其在肿瘤细胞生长中的功能而应用于治疗具有重要的临床意义.     

转化生长因子-β族信号的转导

TGF-β族细胞因子通过各自信号转导产生多种生物学效应,其基本过程是：信号沿TGF-β族配体→受体→SMAD蛋白→转录因子→DNA表达的次序转导.在TGF-β族各因子刺激各自具有蛋白激酶活性的两型膜受体时,各因子先结合Ⅱ型受体,结合配体的Ⅱ型受体再激活Ⅰ型受体.活化的I型受体磷酸化通路特异性SMAD,后者与公用性SMAD结合后从胞浆移至核内,核内SMAD通过与转录因子结合和直接与DNA结合调节基因的表达.     

正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素与阿片受体的表达

为应用猕猴和树鼩动物模型研究毒品成瘾对神经/免疫系统的影响提供基础数据,对大麻素及阿片受体在正常猕猴和树鼩神经系统和免疫系统的表达进行初步确定.采集正常猕猴和树鼩新鲜组织(皮质、小脑、脑干、海马、脊髓、脾脏),应用半定量逆转录PCR和实时定量PCR的方法检测大麻素与阿片受体mRNA在猕猴和树鼩各组织中的表达情况.猕猴脑部各区包括脾脏均表达大麻索受体1(CNR1),而大麻素受体2(CNR2)只表达于脾脏内.三类阿片受体中,mu(μ)受体表达最为广泛,在以上各组织中均有表达;delta(δ)受体表达的组织最少,只在海马表达;kappa(κ)受体表达介于两者之间,分别在皮质、小脑、脑干、脊髓中表达.在树鼩组织中,CNR1和CNR2表达于整个大脑重要脑区中,且CNR1表达量高于同一区域内CNR2表达的鼍:脾脏中CNR2的表达较高,而CNR1不表达.三类阿片受体只有检测到μ受体在脑部与脾脏表达,且在各个脑区的表达量明显高于脾脏的表达量;δ体和κ受体在被检各个组织中均无表达.总体而言,两种大麻素受体在猕猴和树鼩体内表达情况与人类和鼠的情况类似,而三类阿片受体在猕猴体内表达情况与人类吏为接近.猕猴和树鼩可能可用于人类毒品成瘾的研究;猕猴在某些神经受体的表达更接近人类,其在研究毒品成瘾的机理和对免疫系统的影响方面仍有不可替代的地位.     

脑内发现全新的阿片受体样受体及其内源性配体

１９９４年克隆了一种孤儿受体－－阿片受体样受体。１９９５年又发现其内源性配体ＯＦＱ或Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ。ＯＲＬ受体与已知的阿片受体有５０％同源性,ＯＦＱ则与强啡肽Ａ化学结构高度相似,这两系统在功能上可能既有相反的作用,又有相似的作用,其详情正研究中。     

人高密度脂蛋白受体胞外片段在甲醇酵母中的表达

高密度脂蛋白受体在胆固醇逆向运输中起重要作用,并且其可以做为动脉粥样硬化的新型治疗靶点。为了构建以竞争性受体-配体相互作用为基础的体外高通量药物筛选模型,在甲醇酵母中表达了高密度脂蛋白受体胞外结构域。应用RT-PCR方法从人肝癌Bel-7402总RNA中扩增了编码高密度脂蛋白受体胞外结构域的基因片段,此基因片段测序证实后亚克隆至甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中。经测序验证读码框正确后将重组质粒电转至Pichia pastorisGS115中。应用PCR方法确定目的基因的整合和Mut^ 表型。重组菌株用1％甲醇诱导5天后取发酵上清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在分子量约64.5kDa处有sHDLR表达。随后应用Dil-AcLDL为配体证明了表达的sHDLR具有结合其配体AcLDL的生物学活性。     

血清饥饿条件下δ阿片受体激活对心肌细胞存活的影响

目的:研究血清饥饿对心肌造成损伤过程中,δ阿片受体激活是否对心肌细胞的存活起保护作用.方法:体外原代培养乳大鼠心肌细胞.结晶紫法测定心肌细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期S G2 M百分比;流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡指数; Western蛋白印迹法检测心肌细胞胞浆内caspase-3蛋白表达.结果:体外原代培养乳大鼠心肌细胞经无血清培养48小时后,心肌细胞出现明显的凋亡,caspase-3表达增加;当给予不同浓度的δ阿片受体激动剂[D-Ala2,D-Leu5]脑啡肽(DADLE)作用于心肌细胞后,能明显抑制心肌细胞凋亡,并且0.1 μmol·L-1DADLE的作用最为显著,表现为,心肌细胞活力增加,心肌细胞的 S G2 M百分比升高;心肌细胞的凋亡指数下降,caspase-3蛋白表达降低; 0.1 μmol·L-1DADLE对心肌细胞的保护作用能被δ阿片受体拮抗剂naltrindole 10μmol·L-1完全阻断,表现为,心肌细胞活力降低,心肌细胞的凋亡指数升高;心肌细胞的 S G2 M百分比降低;caspase-3的蛋白表达明显升高;说明DADLE通过激活δ阿片受体对心肌细胞起保护作用.结论:在血清饥饿条件下,δ阿片受体激活对心肌细胞的存活有保护作用.     

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .     

β2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定

为提高β2－肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2－肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。     

人干细胞因子受体c-Kit稳定表达细胞株的构建

 干细胞因子 (SCF)是一种重要的造血因子 ,其受体c Kit具有酪氨酸激酶活性 .SCF c Kit介导的细胞内信号转导在造血、肥大细胞的生成及其功能、以及生殖细胞和黑色素细胞的发育中起着关键的作用 .通过构建人c kitcDNA的pcDNA3.1真核表达载体 ,转染不表达人c kit的小鼠髓系祖细胞FDC P1.经Zeocin抗性筛选 ,PCR、RT PCR、Western印迹分析、流式细胞仪分析等方法检测到人c kit基因的稳定整合和表达 ,并分布于细胞表面 ,证明获得了稳定表达人c Kit受体的细胞株 .用MTT法检测重组细胞株增殖特性 ,表明重组人SCF可刺激其增殖 .为进一步研究人c Kit受体介导的细胞内信号转导及检测重组人干细胞因子生物学活性提供了有效的细胞模型     

VLDL—受体重复序列的诱变缺失与配体结合力的关系

极低密度脂蛋白受体 (VLDL R)的配体结合域上存在 8个富含半胱氨酸的重复序列 (ligand bindingre peats,LBR) ,被认为是与配体结合的部位。该受体与含 7个类似重复序列的低密度脂蛋白受体 (LDL R)配体结合特性明显不同。为了明确VLDL R中 8个LBR在与配体结合中的作用并探讨VLDL R与LDL R结合特性差异原因 ,采用基因缺失诱变方法 ,构建了各种不同重复序列缺失的VLDL R重组体。将其分别导入无LDL R功能性表达的ldl A7细胞。转染细胞与荧光标记的VLDL、β VLDL及LDL的结合实验结果表明 ,LBR1和LBR2对结合富含apoE的脂蛋白 (VLDL ,β VLDL)最为重要 ;LBR3和LBR6对结合VLDL也有重要作用 ,但对结合 β VLDL无明显影响。结果同时表明 ,LBR7缺失的VLDL R表现出部分LDL R的结合特性 ,提示该重复序列可能是VLDL R与LDL R配体结合特性差异的部分原因     

甲硫氨酸脑啡肽和抗δ阿片受体抗体对小鼠骨髓瘤细胞信号传递系统的作用

为了探讨阿片肽与细胞表面受体结合后所产生的生物效应及其机制 ,用不同浓度甲硫氨酸脑啡肽 ( MENK)及抗 δ阿片受体单克隆抗体处理小鼠的骨髓瘤细胞 ( NS- 1 ) ,然后测定蛋白激酶A( PKA) ,蛋白激酶 C( PKC)活性及三磷酸肌醇 ( IP3 )含量 .研究结果表明 ,NENK可升高细胞胞浆及胞膜 PKA的活性 ,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗 .MENK对 PKC影响呈双向反应 ,0 .1 μmol/L MENK可以升高胞浆 PKC活性 ,但却明显降低胞膜 PKC活性 ;在 MENK浓度为 1 0μmol/L时则情况刚好相反 .1 μmol/L的 MENK可明显降低胞浆及胞膜 PKC活性 ,抗体可拮抗这种下调作用 .MENK可降低细胞内 IP3 的含量 ,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗 .由此可以推论 :MENK在与 δ阿片受体结合后 ,可以经过多种信号传导系统来调节细胞功能 ,从而产生不同的生物效应 .